慢性乙型肝炎患者血清cccDNA定量檢測臨床相關意義研究

【摘要】  　　目的 探討慢性乙型肝炎（CHB）患者血清中cccDNA為肝臟損害的臨床標志。方法 隨機選取慢性乙型肝炎輕中度、慢性乙型肝炎重度及重型、乙肝病毒攜帶者各20例（所有病例HBV DNA均陽性）。使用實時熒光定量PCR法分別檢測入選病例血清中cccDNA值及同時定量檢測血清中HBV DNA和ALT、AST、TBIL。結果 3組之間cccDNA拷貝數(shù)分布位置不相同，存在差別（P=0.000<0.01）。60例患者血清中cccDNA值和ALT秩相關（Rs=0.612， P=0.000<0.01 ） ；cccDNA值與AST秩相關（Rs=0.632，P=0.000<0.01）；cccDNA值與TBIL秩相關（Rs=0.337, P=0.008<0.01，但Rs＜0.4）。 結論 患者血清中cccDNA為肝臟損害的標志，可作為判斷肝功能損害的又1臨床參數(shù)。

【關鍵詞】  慢性乙型肝炎；cccDNA；實時熒光定量PCR；肝臟損害

    【Abstract】  Objective  To verify the cccDNA in chronic hepatitis B patients’ sera is an signal of the liver damage.Mthods  Selected randomly 20 slight and mild patients with chronic hepatitis B,20  patients with severe chronic hepatitis  and 20 HBV viral carriers(all patients were HBV DNA positive).The cccDNA of the 60 invesgated patients were detected by selective real-time fluorescent quantitative PCR, HBV DNA were detected by routine PCR, and the ALT 、AST and TBILl were detected by routine method. Results  There was significantly different in the quantify of  three groups’cccDNA in sera(P=0.000<0.01). The serum cccDNA level of chronic hepatitis B patients was correlated with the level of ALT（Rs=0.612,   P=0.000<0.01 ）, with AST（Rs=0.632, P=0.000<0.01）, with TBIL（Rs=0.337, P=0.008<0.01,but Rs<0.4）. Conclusion  The cccDNA was an signal of liver damage,may be another important clinical parameter.

    【Key words】  chronic hepatitis B；cccDNA；liver damage ；real-time fluorescent quantitative PCR

    肝細胞核內(nèi)有穩(wěn)定的共價閉合環(huán)狀DNA（covalently circular closed DNA, cccDNA）存在，為保持慢性感染的基礎。研究發(fā)現(xiàn)部分患者血清中出現(xiàn)cccDNA，可能為肝臟損害釋放至血液中［1］。筆者采用實時熒光定量PCR定量檢測慢性乙肝（CHB）患者血清中cccDNA，探討患者血清中cccDNA的臨床相關意義。                                    

    1  對象與方法

    1.1  研究對象  隨機選取南昌市第9醫(yī)院住院和門診CHB患者或病毒攜帶者，所有入選患者血清中HBV DNA均為陽性，共計60例。CHB輕中度、CHB重度及重型、乙肝病毒攜帶者各20例。診斷符合2000年9月中華醫(yī)學會傳染病與寄生蟲學會、肝病學分會聯(lián)合修訂的病毒性肝炎防治方案，全部患者均經(jīng)血清免疫學檢查確診，無合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎。同時排除了酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病等損害肝臟的原因。

    1.2  標本采集與保存  患者入院次日測cccDNA水平。采靜脈血5ml，檢測肝功能、乙肝病毒標志物、HBV DNA定量等，另1份靜脈血5ml離心后儲藏于-70℃冰箱。

    1.3  HBV cccDNA檢測  采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）。用德國羅氏公司LightCycler 定量PCR儀檢測，試劑盒購于藍星生物科技開發(fā)有限公司，檢測值用拷貝/ml。

    1.4  統(tǒng)計學處理  用SPSS11.5進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計學方法為1般性描述統(tǒng)計，秩和檢驗，秩相關。

    2  結果

    2．1  CHB患者血清中cccDNA水平3組之間的比較  CHB輕中度組在發(fā)病初均能檢測出cccDNA；CHB重度及重型組17例檢出cccDNA，且拷貝數(shù)高，3例陰性；乙肝病毒攜帶者組只有1例陽性，其余均陰性。3組之間cccDNA水平分布位置不相同，差異有顯著性（P=0.000＜0.01）；CHB輕中度組與乙肝病毒攜帶者組cccDNA水平分布位置明顯不相同，差異有顯著性（P=0.000＜0.01）；CHB輕重度及重型組與乙肝病毒攜帶者組cccDNA水平分布位置明顯不相同，差異有顯著性（P=0.000＜0.01）；但CHB輕中度組與CHB重度及重型組水平分布位置差異無顯著性，雙側(cè)檢驗P=0.330，雙側(cè)確切概率P=0.341＞0.05,故CHB輕中度組與CHB重度及重型組cccDNA水平差異無顯著性,見表1。表1  3組之間cccDNA水平的比較注：1組為CHB輕中度組，2組為CHB重度及重型組，3組為乙肝病毒攜帶者組(以上數(shù)值為log10對數(shù)值)

    2.2  CHB患者血清中cccDNA水平與ALT、AST相關性分析  CHB患者血清cccDNA水平與AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）的秩相關系數(shù)Rs=0.632,P=0.000＜0.01，可以認為CHB患者血清cccDNA水平與AST存在正相關關系；CHB患者血清cccDNA水平與ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）的秩相關系數(shù)Rs=0.612,P=0.000＜0.01，可以認為CHB患者血清cccDNA水平與ALT存在正相關關系。

    3  討論

    乙肝病毒復制是1種保守的機制，在轉(zhuǎn)錄后模板仍然完整。HBV DNA復制周期，開始于cccDNA，cccDNA轉(zhuǎn)錄前基因組RNA；反轉(zhuǎn)錄為負鏈DNA；再合成正鏈DNA；雙鏈DNA又成熟為cccDNA，是1個連續(xù)的過程［1］。慢性乙型肝炎患者血清中HBV cccDNA以往多用Southern blot 方法進行檢測，該方法是分子生物學的經(jīng)典方法，但操作者的技術要求較高，且步驟繁瑣，靈敏度較低［2］。近年來，也有較多文獻報道用PCR技術對cccDNA進行檢測［3］。He等［4］建立了實時熒光定量檢測cccDNA的方法。Chen等［5］用此種靈敏的實時熒光定量PCR法定量檢測10例CHB患者血清和肝組織中cccDNA，發(fā)現(xiàn)只有6例陽性，且血清cccDNA水平和患者血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和病毒載量相關。證實了該檢測方法的靈敏性高、特異性強，并認為患者外周血清中出現(xiàn)cccDNA可能為肝臟出現(xiàn)損害（如炎癥、壞死等）的早期表現(xiàn)。繆曉輝、等［3,6］對患者血清中cccDNA與乙肝患者病情輕重、病程進展的關系進行了相關研究。

    從理論上推測，既然存在于肝細胞胞質(zhì)和線粒體中的轉(zhuǎn)氨酶等酶類在肝細胞被破壞時能釋放到血液中，那么存在于肝細胞核內(nèi)的cccDNA分子在肝細胞變性、壞死時應該也可以釋放到血液中，而且病情越嚴重，變性壞死的細胞越多，對于同1個患者而言，在某1時間段內(nèi)，其中的cccDNA水平應該也相應的越高，對判斷病情有意義。目前通過肝活檢來監(jiān)測乙肝患者肝組織中的cccDNA水平變化存在著1定困難，因而監(jiān)測血液中的cccDNA動態(tài)變化也許更具有現(xiàn)實意義。

    本文對60例HBV DNA均陽性CHB患者進行分組，使用實時熒光定量PCR法檢測患者血清中cccDNA。結果發(fā)現(xiàn)CHB輕中度組、重度及重型組、乙肝病毒攜帶組3組之間cccDNA水平分布位置差異有顯著性；但CHB輕中度組與重度及重型組之間cccDNA水平分布位置差異無顯著性；且60例患者血清cccDNA水平與代表肝功能損害的ALT、AST存在正相關關系。因此，可以初步認為CHB患者血清中出現(xiàn)cccDNA是肝臟損害的標志，可以反應病情的輕重及病情的進展，同時也反應了實時熒光定量PCR法檢測CHB患者血清HBV cccDNA靈敏性較高、特異性強，可以應用于臨床來監(jiān)測乙肝患者血清中cccDNA的水平及動態(tài)變化。但也存在不少問題：本次樣本量較小及所有的患者的HBV DNA均為陽性；CHB輕中度組與重度及重型組之間cccDNA水平差異無顯著性，以致cccDNA水平不能確切反應患者病情輕重；另外，CHB患者的ALT、AST易受降轉(zhuǎn)氨酶藥物治療等原因的影響。有待進1步增加樣本數(shù)量及動態(tài)觀察慢性乙型肝炎患者發(fā)病各期的cccDNA水平，以致確定HBV cccDNA水平與乙肝患者病情輕重、病情進展的關系［7］。

【參考文獻】
  1 駱抗先.乙型肝炎基礎和臨床,第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001,29-32.

2 Li XM, Yang YB,Hou HY， et al .Interruptoin of HBV intrauterine transmission, A clinical study .World J Gastroenterol, 2003,9:1501-1503.

3 Lu XY, Block TM, Gerlich WH. Protease-induced infectivity of hepatitis B virus for a human hepatoblastoblastoma cell line.J Virol, 1996,70:2277-2285.

4 He ML,Wu J,Chen YC,et al .A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR .Biochem Biophys Res Commun, 2002, 295:1102-1107.

5 Ying Chen,Johnny Sze,Ming-Ling He .HBV cccDNA patients,sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage .World J Gastroenterol,2004,10(1):82-85.

6 繆曉輝，趙克開.乙肝病毒cccDNA檢測方法與臨床意義.中華醫(yī)學會第102次全國病毒性肝炎及肝病學術會議論文匯編,2005，5：45-48.

7 張濤，高英堂，韓濤.乙肝病毒cccDNA的研究進展.國外醫(yī)學·病毒學分冊,2005，12（6）：161-165.

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