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逍遙散對慢性溫和不可預知應激模型大鼠的影響
類神經遞質含量的影響。方法：應用慢性溫和不可預知應激程序對大鼠進行為期11 周的造模，造模后3 周，分別采用逍遙散（19.5g·kg-1、25.0g·kg-1）和丙咪嗪（10mg·kg-1）對模型大鼠進行為期8 周的治療。實驗進程中，定期測定大鼠體重、糖水消耗量；應用開場實驗測定大鼠爬行格子數和站立次數；造模、治療結束后處死大鼠，解剖分離大鼠皮層和海馬部位，采用熒光分光光度法測定5-HIAA、5-HT、DA 和NE 含量。結果：與正常對照組比較，大鼠造模后3 周糖水消耗量、爬行格子數和站立次數均明顯減少（p<0.01）；與模型對照組比較，逍遙散19.5、25.0g·kg-1 連續(xù)給藥2 周能顯著增加糖水消耗量，但給藥4 周、7 周對糖水消耗量影響不明顯；與模型對照組比較，逍遙散25.0g·kg-1 連續(xù)給藥7 周，對大鼠體重、爬行格子數和站立次數表現出提高趨勢（p>0.05）;逍遙散25.0g·kg-1 連續(xù)給藥8 周,能明顯提高模型大鼠皮層部位5-HT 含量及海馬部位5-HIAA 含量（p<0.05，p<0.01）。結論：逍遙散對CUMS 抑郁模型大鼠表現出抗抑郁作用，作用機制與影響腦內單胺類神經遞質5-HT 活性有關。
關鍵詞：逍遙散；慢性溫和不可預知應激（CUMS）；抗抑郁
逍遙散出自宋朝《太平惠民和劑局方》，是中醫(yī)調和肝脾的代表方劑之一，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾之功效，用于治療肝郁血虛脾弱證。作為調節(jié)情志的經典名方，現代臨床中逍遙散被廣泛用于精神科疾病的治療，其中在抑郁癥的治療中應用較多，能使患者情志舒暢、心情愉快、精神狀態(tài)得以改善，療效明確，但治療機制至今尚未完全闡明。實驗研究發(fā)現[1-3]，逍遙散（10.0g·kg-1 和20.0g·kg-1）連續(xù)給藥6 天，每日2 次，能明顯升高正常大鼠下丘腦去甲腎上腺素(NE)和紋狀體多巴胺(DA)含量；連續(xù)4 周采用“頸部帶枷單籠喂養(yǎng)法”造成大鼠肝郁證模型，逍遙散水煎劑連續(xù)治療2 周后，能降低模型大鼠大腦、間腦和腦干部位中5-羥色胺(5-HT)與DA 含量，升高NE 含量；對“慢性束縛應激法”所致肝郁證模型大鼠，造模1周后用逍遙散（19.2g·kg-1）治療4 周，能顯著提高模型大鼠腦組織中NE 和DA 水平。研究結果提示逍遙散對中樞神經系統5-HT、NE 及DA 能神經遞質的影響作用，可能是其發(fā)揮“疏肝解郁”功效的藥理學基礎之一。
由于抑郁癥的形成是致病因素長期作用的結果，因此在抑郁動物模型的制備時，必須考慮長期、多致病因素的疊加作用。慢性溫和不可預知應激模型(Chronic Unpredictable MildStress, CUMS)的制備，是采用隨機組合的多種不同應激因子（如冰水游泳、噪音刺激、異物刺激等）對動物長期刺激而進行造模。該模型能較好地模擬人類抑郁的核心癥狀——快感缺失[4,5]（以糖水消耗量反映），同時模擬了抑郁患者運動能力、社交能力、探索行為能力下降等癥狀表現，也能造成腦內單胺類神經遞質(5-HT、NE 和DA)含量的改變[6,7]，其理論依據與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激源促進疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機制更接近，是目前較為推崇、使用廣泛的抑郁動物模型[7-13]。本研究采用CUMS 程序復制大鼠抑郁模型，觀察逍遙散對該模型大鼠體重、活動量、糖水消耗量及腦內單胺類神經遞質水平的影響，以期為逍遙散“疏肝解郁”之功效及臨床治療抑郁癥的應用提供藥理學依據。
1. 材料與方法
1.1 動物
SD 大鼠，♂，清潔級，初始體重190-220g，四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供。合格證號：scxk（川）2004-16。
1.2 藥物
逍遙散(Xiaoyao San, XYS)：柴胡9g，當歸9g，白芍9g，白術9g，茯苓9g，薄荷4.5g，生姜4.5g，甘草4.5g。藥材購于成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。以浸膏量為評判指標，采用3×3因素正交表，綜合考察加水量、煎煮時間和煎煮次數三者的影響作用，經DPSv3.01 軟件統計分析后，確定逍遙散水煎劑的制備工藝如下：藥材加4 倍量水，煮沸后煎煮20min，同法煎煮三次，合并三次濾液，濃縮成1.25g·ml-1 的藥液，4℃冰箱保存。此外，取適量濃縮液、柴胡標準藥材（四川省藥品監(jiān)督管理所，批號120992－200504）及配方中柴胡藥材的甲醛溶液（參照2005 版藥典第198 頁所記載的方法處理），在同一硅膠G 薄層板上點樣，于365nm紫外燈下檢查，三者均在薄層板上的相同位置顯示相同顏色的柴胡總皂苷熒光斑點，表明復方所用柴胡符合藥典規(guī)定，且水煎劑中柴胡可被檢出。
丙咪嗪 (Imipramine, IMI)：Sigma，批號I0899。生理鹽水配制成1mg·ml-1 溶液，臨用前配制。
1.3 開場實驗
參照Chen CZ [13]方法，將大鼠放入自制開場實驗箱的中心位置（100cm×100cm木箱，底部等分為100個10cm×10cm小格），適應2min后，觀察隨后4min內大鼠的爬格子數（以大鼠的四肢均進入一個格子為一格）和站立次數（以大鼠的兩前肢離開地面，身體直立為一次）。開場實驗分別在大鼠分組前、造模3周及10周后進行，共3次。
1.4 糖水消耗實驗
參照 Stathis 方法[7]，開始造模前一周里對大鼠進行2 次1%蔗糖水偏好訓練（每個鼠籠放置已定量的2 個喂水瓶，1 瓶純水，1 瓶1%蔗糖水，喂水1h 后撤除）。于CUMS 程序開始前進行第一次糖水消耗量(Sucrose Consumption，SC)測試。糖水偏好訓練和測試均于大鼠禁食禁水23h 后進行
1.5 慢性溫和不可預知應激模型的建立
參照Stathis方法[7]略作改變。刺激因子包括電刺激＋噪音、冰水（4℃）游泳、禁食、鼠籠（45o）傾斜、潮濕墊料、禁水、合籠、禁食禁水、異物放置、異味刺激，具體執(zhí)行安排見下表。共執(zhí)行11周。
1.6 實驗分組與給藥方式
大鼠適應性飼養(yǎng) 1 周，5 只/籠。1 周后根據體重和開場實驗結果隨機分為正常對照組和模型組，正常對照組的大鼠5 只/籠，模型組的大鼠均單籠飼養(yǎng)。模型組大鼠造模3 周后，按體重和開場實驗結果隨機分為模型對照組、模型+逍遙散高、低劑量組、模型+丙咪嗪組，動物仍保持單籠飼養(yǎng)，正常對照組動物飼養(yǎng)方式不變。造模第4 周開始，模型對照組每日灌胃蒸餾水，模型+逍遙散高、低劑量組每日灌胃逍遙散水煎劑（劑量分別為25g·kg-1、19.5g·kg-1），給藥體積2ml·100g-1。模型+丙咪嗪組每日腹腔注丙咪嗪15mg·kg-1，給藥體積1ml·100g-1。各組動物連續(xù)給藥8 周。
1.7 大鼠皮層與海馬部位單胺類神經遞質的測定
各組大鼠末次給藥 30min 后處死，在冰臺上迅速分離大腦皮質和海馬部位，稱重后于干冰中快速冷凍，置-70℃保存待測。大鼠大腦皮層和海馬部位5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、5-HT、NE 及DA 含量測定采用熒光分光光度法測定（RF-5301 型熒光分光光度儀，日本島津）。
1.8 統計學處理
數據以 X ±s表示，各組數據呈正態(tài)分布時采用SPSS11.5統計軟件進行One-Way ANOVA分析，非正態(tài)分布采用DPSv3.01統計軟件進行K-W檢驗。
2. 結果
2.1 CUMS 程序實施前及實施后1、3 周對大鼠開場實驗和糖水消耗量的影響
見表2。CUMS程序實施前正常對照組與模型組大鼠的體重、爬行格子數和站立次數均無明顯差異，但模型組大鼠的糖水消耗量顯著減少，提示單籠飼養(yǎng)對動物獎賞反應性的抑制。
CUMS程序實施1周后，與正常對照組比較，模型組大鼠的體重無顯著差異，糖水消耗量仍表現出明顯的下降。CUMS程序實施3周后，與正常對照組比較，模型組大鼠的爬行格子數、站立次數和糖水消耗量均顯著減少，但體重無明顯差異，提示CUMS程序的應用已引起動物快感缺乏、運動能力和探索能力下降。
2.2 逍遙散單次給藥及連續(xù)給藥2 周、4 周對CUMS 模型大鼠體重和糖水消耗量的影響
逍遙散給藥1 次對模型動物的糖水消耗量無顯著影響；連續(xù)給藥2 周，逍遙散高、低劑量能明顯提高模型動物的糖水消耗量，體重影響不明顯；連續(xù)給藥4 周，逍遙散提高模型動物糖水消耗量的作用反而減弱，僅表現出一定提高趨勢。
2.3 逍遙散連續(xù)給藥7 周對CUMS 模型大鼠開場實驗和糖水消耗量的影響
在CUMS 程序連續(xù)實施的10 周，與正常對照組比較，模型組大鼠開場實驗中的爬行格子數與站立次數、及糖水消耗量等指標仍表現出低下，提示該模型的有效性和持續(xù)性。與模型對照組比較，逍遙散連續(xù)給藥7 周對以上指標改善作用不明顯。
2.4 逍遙散連續(xù)給藥 8 周對CUMS 模型大鼠大腦皮層和海馬部位單胺類神經遞質含量的影響
與正常對照組比較，模型對照組的大鼠皮質部位5-HT、DA 和NE 含量，以及海馬部位5-HIAA 含量均明顯降低，逍遙散連續(xù)給藥8 周，能顯著提高皮層5-HT 含量和海馬部位5-HIAA 含量，并對皮層部位DA 和NE 含量表現出提高趨勢。
3. 討論
3.1CUMS 抑郁模型的評價
采用 CUMS 程序處理大鼠3 周后，與正常對照組的大鼠比較，模型大鼠爬行次數、站立次數及糖水消耗量均明顯降低（P<0.01，P<0.05），由于大鼠的爬行格子數能反映其活動性，站立次數能反映其對周圍環(huán)境的好奇性與探索性，糖水消耗量能反映其對獎賞的反應性，因此結果表明本研究所采用的CUMS 程序，能在大鼠身上模擬抑郁癥病人所表現出的冷漠、運動減少及快感缺失等臨床特征；進一步連續(xù)造模至10 周，與正常對照組比較，模型組大鼠的爬行次數、站立次數及糖水消耗量依然顯著低下，且體重均有所減輕，提示能模擬臨床抑郁癥病人食量減少、體重下降的表現。綜上，本研究CUMS 造模程序能持續(xù)、有效地引起大鼠快感的缺乏，表明模型的成功。此外，大鼠開場實驗的次數，部分文獻報道一周一次，本研究僅進行3 次，且間隔時間不同，主要依據于前期實驗結果發(fā)現：每周一次，動物對實驗環(huán)境易產生適應性，易出現假陰性結果。
單胺類神經遞質假說在抑郁癥的發(fā)病機制中占有重要地位，本研究發(fā)現大鼠經CUMS程序連續(xù)處理11 周后，可導致模型大鼠皮質部位5-HT、DA 和NE 水平，以及海馬部位5-HIAA 的含量明顯低于正常對照組，但海馬部位5-HT、DA 和NE 水平變化不明顯，這與臨床上多數抑郁癥患者腦內5-HT 和NE 水平低下相似，可認為該模型的成功。至于皮層與海馬部位遞質水平變化的不同，筆者推測這與中樞NE 和5-HT 能神經末梢主要投射于大腦新皮質，少量分布于海馬有關，因此作為與抑郁癥關系最密切的神經遞質，NE 和5-HT 含量的變化在皮質部位較為顯著。但亦有抑郁癥慢性應激程序（非慢性溫和不可預知應激，但也是多種不同的刺激反復作用，只是強度偏大）連續(xù)實施4 周，模型大鼠海馬部位5-HT 含量變化較皮質部位更為顯著的報道[6]，故模型動物腦內單胺類神經遞質的變化與刺激強度、刺激時間不同等因素有關。
3.2 逍遙散對CUMS 抑郁模型的影響
本研究結果表明，經逍遙散水煎劑25g·kg-1連續(xù)治療7周后，治療組大鼠的體重、活動量較模型組均有增加，提示逍遙散能對抗CUMS造模程序對動物活動量和體重的抑制作用，與逍遙丸連續(xù)預防性給藥21天提高CUMS模型大鼠體重與自主活動的文獻報道相似（這篇文章只觀察了逍遙散對模型大鼠自主活動的作用，沒有對體重的影響，現在逍遙散對CUMS模型大鼠體重的影響還沒有看見報道）[15]。但是，逍遙散治療后對模型大鼠糖水消耗量的提高作用并未表現出連續(xù)性，在治療2周時能顯著提高模型動物的糖水消耗量，在后面的治療過程中僅表現出提高趨勢或無明顯影響作用。查閱資料及結合本研究室其他實驗結果（另報道），筆者認為可能與以下影響因素有關：（1）動物種系，有學者就Wistar和SD大鼠對糖水消耗的反應性進行過比較[7]，發(fā)現Wistar大鼠更易出現糖水消耗量下降現象，丙咪嗪對Wistar大鼠的治療效果顯著優(yōu)于SD大鼠。（2）5-HT受體密度或功能的改變，有報道顯示[16]，CUMS程序持續(xù)8－9周可導致大鼠大腦皮質5-HT2A受體密度上升，而本室前期小鼠實驗研究初步提示，逍遙散急性給藥可顯著拮抗5-HT2A受體，長期給藥則使該受體出現敏感性下調的表現，由此推測逍遙散給藥2周提高CUMS模型大鼠糖水消耗量的作用與阻斷5-HT2A受體有關，然而隨給藥時間和CUMS程序實施時間的延長，模型大鼠皮質部位5-HT水平逐漸下降而5-HT2A受體密度逐漸升高，雖然逍遙散可使5-HT2A受體的敏感性降低，但由于其密度增加，二者作用相互抵消，故逍遙散提高糖水消耗量的作用不明顯。（3）實驗操作，由于大鼠對喂水瓶有啃咬行為，導致個別糖水消耗測定實驗中喂水瓶漏水從而直接影響實驗結果，因此確保喂水瓶的密閉性至關重要。
實驗結果表明，逍遙散連續(xù)8 周治療后對模型大鼠大腦皮質部位5-HT、DA 和NE 含量的降低有對抗效應，其中以提高皮質部位5-HT 含量的作用尤為顯著，但對5-HT 的代謝產物5-HIAA 含量影響不明顯，提示逍遙散可能通過促進皮質部位5-HT 合成、抑制5-HT 代謝或再攝取而提高5-HT 水平；逍遙散連續(xù)8 周治療后對模型大鼠大腦海馬部位5-HIAA 含量的降低有明顯升高作用，但對5-HT 含量影響不明顯，提示逍遙散可能促進模型動物海馬部位5-HT 的更新。綜上，筆者認為逍遙散的抗抑郁作用可能主要與影響不同腦區(qū)5-HT 能神經系統活性有關。
本次研究發(fā)現，三環(huán)類抗抑郁藥丙咪嗪對模型動物體重影響不明顯，這可能與藥物長期給予所致的毒性有關，結果與文獻報道亦相吻合[7]。雖然丙咪嗪能通過抑制突觸前膜對NE、5-HT 的重攝取從而提高突觸間隙遞質濃度達到抗抑郁作用，但長期給予會引起神經系統的適應性，應通過增加劑量達到原有效應；此外，遞質在突觸間隙中濃度的增加也會加速其被單胺氧化酶滅活的過程，因此本次實驗發(fā)現，長期應用丙咪嗪對模型大鼠腦內單胺類神經遞質含量的影響并不明顯。
綜上，基于模型大鼠行為學、糖水消耗量及腦內單胺類神經遞質含量的變化，本次研究所采用的CUMS 造模程序成功地制備了大鼠抑郁模型，證明了該造模方法的有效性，但同時應注意動物種系、刺激因子的強度與安排、實驗條件的一致性等眾多影響因素對造模效果和指標準確性的影響。逍遙散連續(xù)治療給藥2 周對模型大鼠糖水消耗量的異常變化有一定的對抗效應，但此效應未表現出持續(xù)性，推測與逍遙散長期給藥引起5-HT2A 受體敏感性下調、而造模程序引起該受體密度上升這一矛盾有關；逍遙散連續(xù)治療給藥8 周，能顯著提高模型大鼠大腦皮層單胺類神經遞質含量，特別是5-HT 水平，其次能升高海馬部位5-HIAA 含量。
以上實驗結果表明逍遙散具有抗抑郁作用，作用機制可能與影響中樞5-HT 能神經系統活性有關，但對于逍遙散是否直接影響5-HT2A 受體密度還是影響其功能，是否通過影響5-HT轉運體的功能而影響5-HT 水平的變化，是否對不同腦區(qū)5-HT 能神經系統產生不同的作用，均有待進一步深入研究。
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