銀杏葉提取物對老化紅細(xì)胞膜ATP酶、SOD和MDA影響

【摘要】  目的 觀察銀杏葉提取物（EGb761）作用下老化紅細(xì)胞膜三磷酸腺苷酶（ATPase）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的變化，探討EGb761抗衰老的機(jī)制。方法 采用恒溫水浴箱孵育法模擬紅細(xì)胞的自然衰老過程，觀察EGb761對老化紅細(xì)胞膜MDA含量、SOD和ATPase活性的影響。結(jié)果 與衰老組比較，EGb761組的紅細(xì)胞MDA含量明顯降低，SOD、ATPase活性明顯升高，差異有極顯著意義（t=2.02~70.06，P<0.05、0.001）。結(jié)論 EGb761能提高紅細(xì)胞的抗氧化能力，保護(hù)紅細(xì)胞膜蛋白，減緩紅細(xì)胞的老化過程。 
【關(guān)鍵詞】  銀杏葉提取物 紅細(xì)胞膜 超氧化物歧化酶 丙二醛

［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effects of Ginkgo biloba extracts (EGb761) on erythrocyte survival, and explore the protective mechanism of EGb761 on erythrocyte.MethodsAfter 24 hours’ incubation in thermostatic waterbath, the concentration of the product of erythrocyte lipid peroxidation-malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) and ATPase in RBC were measured.ResultsCompared with the aging group，EGb761 could significantly decrease the erythrocyte MDA concentration and improve the activity of SOD and ATPase (t=2.02-70.06;P<0.05,0.001).ConclusionEGb761 can directly resist the erythrocyte membrane lipid peroxidation injury from aging.
    ［KEY WORDS］Ginkgo biloba extracts; Erythrocyte membrane; Superoxide dismutase; Malondialdehyde
    近年來，國內(nèi)外對于銀杏葉提取物(EGb761)進(jìn)行了全方位的研究，關(guān)于其主要活性成分銀杏葉黃酮和銀杏內(nèi)酯的藥理作用研究已卓有成效，其對心腦血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用已得到各國醫(yī)學(xué)界的認(rèn)可［1］。其中內(nèi)酯的PAF特異性受體拮抗作用和黃酮類化合物的抗氧化及自由基清除作用近年更受學(xué)者們的青睞，是人們關(guān)注的焦點［2~4］。本文采用37 ℃恒溫水浴箱孵育法模擬紅細(xì)胞的自然衰老過程，觀察EGb761對老化紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）濃度、紅細(xì)胞超氧化物歧化酶（SOD）和紅細(xì)胞三磷酸腺苷酶（ATPase）活性的影響，以探討EGb761在體外對脂質(zhì)過氧化損傷引起的紅細(xì)胞老化的影響及其減緩紅細(xì)胞老化的機(jī)制。
    1  材料與方法
    1.1  材料
    紫外線分光光度計UV-260由CO-PARMEK USA生產(chǎn)；銀杏葉提取物（商品名金納多針劑，內(nèi)含EGb761）由德國威瑪舒培博士藥廠生產(chǎn)；電熱恒溫水浴箱由北京醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；磷酸鹽、Na2EDTA等均為國產(chǎn)分析純試劑；JSM-840掃描電鏡、JEM-1200EX透射電鏡由日本JEOL公司生產(chǎn)。
    1.2  方法
    1.2.1  老化紅細(xì)胞制備  取40例年齡20~61歲的健康成年人肘靜脈血，肝素抗凝,4 ℃下2 500 r/min離心5 min,除去血漿和灰白色的白細(xì)胞層。按1∶2 左右的比例加入PBS磷酸鹽緩沖液（磷酸鹽5 mmol/L，氯化鈉150 mmol/L，pH 7.40）, 混勻后2 500 r/min 離心5 min，吸去上清液及白細(xì)胞層,換洗、離心,重復(fù)3次,最后加PBS磷酸鹽緩沖液配成體積分?jǐn)?shù)為0.05（紅細(xì)胞計數(shù)為5.56×1013/L）的紅細(xì)胞懸液。實驗分成3組：對照組、單純衰老組、EGb761保護(hù)組。
    1.2.2  紅細(xì)胞膜ATPase、SOD活性及MDA含量的測定  采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶試劑盒進(jìn)行檢測。
    1.3  統(tǒng)計學(xué)處理
    實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用PEMS醫(yī)學(xué)統(tǒng)計學(xué)軟件對樣本均數(shù)進(jìn)行t檢驗。
    2  結(jié)    果
    模擬紅細(xì)胞的自然衰老過程，37 ℃孵育24 h后，單純衰老組紅細(xì)胞在老化作用下SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活性均明顯降低，MDA含量明顯增高，與對照組紅細(xì)胞相比差異有顯著性（t=24.17～116.98，P<0.05）。EGb761保護(hù)組衰老紅細(xì)胞的SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活性與單純衰老組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計意義（t=60.06～75.11，P<0.05），但顯著低于對照組（t=15.33～49.33，P<0.05）；紅細(xì)胞MDA含量與單純衰老組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計意義（t=30.19，P<0.05），但仍高于對照組（t=11.68，P<0.05）。見表1。 表1  EGb761對自然衰老紅細(xì)胞MDA、SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase的影響
    3  討    論
    哺乳動物的紅細(xì)胞是研究細(xì)胞老化的很好模型，這是因為：①紅細(xì)胞十分容易得到、分離和純化；②紅細(xì)胞無蛋白合成功能，不可能對損傷進(jìn)行修復(fù)，也沒有新合成蛋白質(zhì)嵌入的影響；③紅細(xì)胞膜是其惟一的質(zhì)膜，分離時不易造成污染，同時其又是紅細(xì)胞唯一的細(xì)胞器，因此用紅細(xì)胞研究與年齡相關(guān)的變化十分有利；④紅細(xì)胞直接暴露在氧高分壓下，又有鐵離子催化，特別易受脂質(zhì)過氧化的損傷。
    自由基對生物細(xì)胞膜損傷的主要方面是產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物,其中最重要的是MDA。MDA是氧自由基與紅細(xì)胞膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化的繼發(fā)性產(chǎn)物，是自由基對生物細(xì)胞膜損傷的最終產(chǎn)物,具有很強(qiáng)的生物毒性, 其產(chǎn)生量與氧自由基的量相平行，MDA 含量增多,可造成膜損傷，影響紅細(xì)胞變形性。
    生理狀態(tài)下,紅細(xì)胞內(nèi)及血漿中存在著一整套清除自由基的酶類和非酶類抗氧化劑,使體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡。SOD是紅細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶和自由基清除劑，能夠有效地清除體內(nèi)自由基, 保護(hù)紅細(xì)胞及機(jī)體免受損傷，對紅細(xì)胞和機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。
    成熟紅細(xì)胞為了適應(yīng)其運行至全身微血管的需要，除了依靠它較強(qiáng)的變形能力外，還要依靠多種酶來完成其能量代謝。ATP酶是紅細(xì)胞能量代謝重要的酶，它在物質(zhì)運送、能量轉(zhuǎn)換以及信息傳遞方面具有重要的作用。它能維持膜兩側(cè)的滲透壓平衡，防止水鈉潴留，具有主動轉(zhuǎn)運鈉、鉀離子的功能。而Ca2+-ATP 酶主要維持紅細(xì)胞內(nèi)Ca2+的主動轉(zhuǎn)運。ATP酶活力的高低是紅細(xì)胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標(biāo)。
    研究表明,老化紅細(xì)胞膜的Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase 酶活力隨其年齡增長而降低。隨年齡增長,紅細(xì)胞膜Na+，K+-ATPase 酶合成量下降,以至Na+、K+離子從膜兩側(cè)的轉(zhuǎn)移率下降,導(dǎo)致機(jī)體能量代謝低下。自由基損傷對其有抑制作用,大量的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),使細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的增加,激活膜磷脂酶,使膜磷脂分解,致使膜對Ca2+的通透性進(jìn)一步增加,又加劇了Ca2+內(nèi)流,導(dǎo)致Ca2+超載。Ca2+超載一方面直接引起線粒體損傷,又可使細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的生化反應(yīng)發(fā)生紊亂,激活許多降解酶,進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

   本研究設(shè)計的紅細(xì)胞衰老模型顯示，孵育（自然衰老）后紅細(xì)胞的SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活性降低，說明隨紅細(xì)胞日齡的增長，紅細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用逐漸加強(qiáng)，紅細(xì)胞的抗氧化能力減低。這是因為隨著循環(huán)中的紅細(xì)胞逐漸衰老，抗氧化劑攝入不足，抗氧化酶類（如SOD 等）合成減少，活性減低。各種耗酶（包括醛縮酶、丙酮酸脫氫酶、ATPase等）無法再生，且其活性逐漸下降，使自由基清除率降低。而同時自由基生成并不減少甚至還增多，這樣，自由基產(chǎn)生與清除失去平衡，脂質(zhì)過氧化作用加劇，MDA 產(chǎn)生、增多，紅細(xì)胞受損、老化加重，引起血管壁硬化及纖維性病變。同時，高鐵血紅蛋白濃度逐漸增加，Na+濃度升高，K+濃度降低，紅細(xì)胞代謝和糖酵解反應(yīng)降低，導(dǎo)致ATP生成不足，不能維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定性而使細(xì)胞形態(tài)異常，機(jī)械脆性增加，紅細(xì)胞膜流動性和變形性降低，使紅細(xì)胞膜損傷，這又加快紅細(xì)胞的老化，導(dǎo)致紅細(xì)胞被吞噬細(xì)胞識別吞噬。
    銀杏藥用歷史悠久,其對疾病的防治作用早在數(shù)千年前就已載入我國中藥寶庫之中，目前臨床上所用的銀杏葉提取物是其標(biāo)準(zhǔn)制劑EGb761，主要成分包括24%的黃酮甙及6%的萜內(nèi)酯類等［1］，后者又包括銀杏內(nèi)酯A、B、C（約2.8%～3.4%）和白果內(nèi)酯(約2.6%～3.2%)�；�礎(chǔ)研究的結(jié)果證實，銀杏葉黃酮分子中含有還原性羥基（-OH）功能基團(tuán)，可直接發(fā)揮抗氧化作用，它可直接捕捉和清除O2-、·OH等多種活性氧簇和過氧化氫、烷類自由基及脂類自由基等脂質(zhì)過氧化物［5］。通過作為一種氫離子供體而阻斷和終止自由基連鎖反應(yīng)鏈，從而阻止和抑制氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)病理性加劇，抑制LPO及其代謝產(chǎn)物MDA和共軛二烯等毒副物質(zhì)的生成［6］。其抗氧化作用強(qiáng)于水溶性還原劑，而與脂溶性抗氧化劑維生素Ｅ（VitE）相當(dāng)，可以消除細(xì)胞膜花生四烯酸代謝過程中產(chǎn)生的自由基。另外，它還參與調(diào)節(jié)和提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，降低全血黏度、血漿黏度等，增加紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷和紅細(xì)胞間排斥力,促使紅細(xì)胞解聚,從而降低血液黏度［7］。
    本文結(jié)果顯示，加入EGb761保護(hù)的紅細(xì)胞經(jīng)過自然衰老過程后，與未加保護(hù)的自然衰老紅細(xì)胞相比，其MDA 含量降低，SOD 和ATP 活力增高，說明EGb761能延緩自由基導(dǎo)致的紅細(xì)胞的自然衰老過程。EGb761在自由基發(fā)生體系中能明顯減少紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化物L(fēng)PO 和MDA 生成和清除超氧陰離子自由基，從而減緩了對SOD 分子結(jié)構(gòu)中巰基（-SH）和對DNA、ATPase 及其他酶的氧化、過氧化以及脂質(zhì)過氧化損傷，從而保護(hù)機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶并提高其活性，加強(qiáng)細(xì)胞清除自由基的能力，提高細(xì)胞的防御功能。這樣，在自由基介導(dǎo)的紅細(xì)胞老化過程中，一方面由于銀杏葉黃酮捕捉和清除了大量自由基，使抗氧化劑的消耗大為減少，保護(hù)了紅細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑和抗氧化酶的含量和活性；另一方面，EGb761又作為抗氧化劑，減少了過氧化作用對紅細(xì)胞中過氧化應(yīng)激敏感性的不飽和脂質(zhì)和各種膜骨架蛋白的損傷，這些作用共同保護(hù)了紅細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性和功能穩(wěn)定性。另外，EGb761還參與調(diào)節(jié)紅細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而保持紅細(xì)胞形態(tài)和體積的恒定，維持細(xì)胞滲透壓平衡。因而EGb761從多個方面延緩了紅細(xì)胞的衰老過程。
 
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