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公衛(wèi)執(zhí)業(yè)醫(yī)師考點(diǎn)：多肽鏈的分離
細(xì)胞核中DNA的某一區(qū)段轉(zhuǎn)錄出來(lái)的mRNA從核孔穿出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，與核糖體結(jié)合起來(lái)。蛋白質(zhì)合成就在核糖體進(jìn)行。蛋白質(zhì)開始合成時(shí)，首先核糖體與mRNA結(jié)合在一起，核糖體附著在mRNA的一端(起動(dòng)部位)，然后沿著mRNA從5′3′方向移動(dòng)(當(dāng)核糖體向前移動(dòng)不久，另一個(gè)核糖體又結(jié)合上去，所以一個(gè)mRNA可以有多個(gè)核糖體連續(xù)上去)。
在測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以前，首先必須保證被測(cè)蛋白質(zhì)的純度，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠。其次要了解它的分子量和亞基數(shù)，按照其亞基數(shù)將蛋白質(zhì)分成幾個(gè)多肽鏈。
蛋白質(zhì)分子多肽鏈的連接有共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合兩種。要拆開以共價(jià)結(jié)合的-S-S-連接的多肽鏈，必須采用的化學(xué)處理方法常有：
�、龠^(guò)甲酸氧化
用氧化劑過(guò)甲酸斷裂-S-S-.這個(gè)反應(yīng)一般在0℃下進(jìn)行2小時(shí)左右，兩個(gè)S就全部能轉(zhuǎn)變成磺酸基，這樣被氧化的半胱氨酸稱為磺基丙氨酸。
如果蛋白質(zhì)分子中同時(shí)存在半胱胺酸，那么也會(huì)被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸也可被氧化，從而增加分析的復(fù)雜性。
�、趲�基乙醇還原
利用還原劑巰基乙醇亦可使蛋白質(zhì)的-S-S-斷裂。當(dāng)高濃度的巰基乙醇在pH8?條件下室溫保溫幾小時(shí)后，可以使-S-S-定量還原為桽H.與此同時(shí)反應(yīng)系統(tǒng)中還需要有8摩爾脲或6摩爾鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性，多肽鏈松散成為無(wú)規(guī)則的構(gòu)型，此時(shí)還原劑就可作用于-S-S-.此反應(yīng)是可逆的，因此要使反應(yīng)完全，疏基乙醇的濃度必需在0.1-0.5摩爾。
�、跜leland試劑的還原作用
Cleland′s指出二硫赤蘇糖醇(dithioerythriotol)及二硫蘇糖醇(dithiothriotol)在氧化還原能力上是比較強(qiáng)的試劑，只要0.01摩爾就能使蛋白質(zhì)的-S-S-還原，反應(yīng)基本與疏基乙醇相似，且在許多球蛋白反應(yīng)中，可以不用變性劑。
Cleland試劑首先與蛋白質(zhì)-S-S-形成中間物，反應(yīng)終了，還原劑被氧化形成一個(gè)穩(wěn)定的六環(huán)化合物，蛋白質(zhì)則被還原。
還原蛋白不穩(wěn)定，SH基極易氧化重新生成-S-S-鍵。穩(wěn)定SH基的方法有：
(A)烷基化試劑使SH基轉(zhuǎn)變?yōu)榉�(wěn)定的硫醚衍生物。
如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸，其產(chǎn)物S?羧氨甲基衍生物不帶電荷，磺代乙酸也可與組氨酸、蛋氨酸和賴氨酸發(fā)生反應(yīng)，但反應(yīng)條件不同，可通過(guò)各種pH及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行控制。
(B)氨乙基化
蛋白質(zhì)分子的幾條肽鏈若以非共價(jià)健結(jié)合，則用尿素、鹽酸胍等變性劑即可拆開。蛋白質(zhì)的多肽鏈被拆開后，將它分離純化，一般多用凝膠過(guò)濾、離子交換、電泳等方法，茲不贅述。
分離純化后的每條肽鏈還要進(jìn)一步分析其末端。
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