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影響免疫檢測(cè)的因素有哪些
影響免疫檢測(cè)的因素有很多，包括緩沖液、封閉、抗體、清洗、檢測(cè)底物等等。下面是yjbys小編為大家?guī)淼挠绊懨庖邫z測(cè)的因素的知識(shí)，歡迎閱讀。
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緩沖液
最常用的兩種緩沖液是磷酸鹽緩沖液(PBS)和Tris緩沖液(TBS)。調(diào)整配方中緩沖液組分的各種改良配方已見諸期刊。緩沖液的關(guān)鍵要求是它應(yīng)有助于保持抗體的生物活性。因此，離子強(qiáng)度和pH值應(yīng)相當(dāng)接近生理狀態(tài)。PBS的配方(磷酸鹽總濃度10mM)適用于廣泛的抗體和檢測(cè)底物。
在孵育過程中，裝有膜的容器應(yīng)輕輕搖動(dòng)。緩沖液的量應(yīng)足夠，完全覆蓋膜，使其在緩沖液中自由漂浮。如果不止一張印跡放在容器中，緩沖液容量不足會(huì)導(dǎo)致印跡膜粘在一起。這將影響孵育溶液的充分接觸，導(dǎo)致各種假象，如背景高、信號(hào)弱和靈敏度不均勻等。
封閉
要獲得有意義的結(jié)果，必須保證抗體只與感興趣的蛋白質(zhì)結(jié)合，而不與膜結(jié)合。利用惰性蛋白、非離子去污劑，或無蛋白的封閉劑來封閉膜上未被占據(jù)的位點(diǎn)，可減少抗體的非特異結(jié)合(NSB)。
封閉劑與膜的親和力應(yīng)高于抗體。它應(yīng)填滿膜上未被占據(jù)的位點(diǎn)，但不會(huì)替換膜上的目標(biāo)蛋白。最常用的封閉劑是牛血清白蛋白(BSA，0.2-5.0%)、脫脂牛奶、酪蛋白、明膠、吐溫20去污劑的稀釋液(0.05-0.1%)以及Blk試劑。封閉劑通常溶解在PBS或TBS中。
與封閉相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)包括：選擇不適當(dāng)?shù)姆忾]劑或過量封閉會(huì)替換或掩蓋目標(biāo)蛋白質(zhì)。因此，封閉劑的正確選擇對(duì)成功的免疫檢測(cè)很關(guān)鍵。例如，奶粉不能用于生物素化或刀豆蛋白標(biāo)記的抗體，因?yàn)榕Ｄ讨泻刑堑鞍缀蜕锼�。在用磷酸化特異性抗體對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)，如果采用粗蛋白制劑作為封閉劑，由于這些制劑中可能含有磷酸酶，而印跡上的磷酸化蛋白會(huì)被這些酶去磷酸化，就有可能會(huì)影響分析結(jié)果。研究表明，在封閉液中添加磷酸酶抑制劑可增強(qiáng)磷酸化特異性抗體的信號(hào)。此外，適用于一種抗原-抗體組合的封閉劑可能不適用于其他組合。
封閉液被點(diǎn)樣在空白的PVDF膜上，而膜已在甲醇中浸潤(rùn)，并在TBS中平衡。隨后在印跡上添加檢測(cè)試劑，孵育5分鐘，并曝光在X射線膠片上。暗斑的出現(xiàn)則表明封閉劑與檢測(cè)試劑不兼容。如果在標(biāo)準(zhǔn)的Western印跡操作中用Immobilon-P轉(zhuǎn)印膜來替代Immobilon-PSQ轉(zhuǎn)印膜，那么封閉液可能不足以飽和膜表面�？赡苄枰嗟那逑床襟E來降低背景。
抗體
在封閉之后，印跡與一個(gè)或多個(gè)抗體孵育。第一個(gè)抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，而第二個(gè)抗體與第一個(gè)結(jié)合。第二個(gè)抗體結(jié)合有酶或染料，可用來指示蛋白的位置。
盡管一抗能直接標(biāo)記，但使用二抗有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，不止一個(gè)二抗分子能夠與單個(gè)一抗分子結(jié)合，形成信號(hào)擴(kuò)增。其次，標(biāo)記的二抗(酶-抗體結(jié)合物)可用于大量不同特異性的.一抗，從而不再需要標(biāo)記多個(gè)一抗。
多克隆或單克隆的一抗都可使用。多克隆抗體通常是以抗血清或親和純化的抗體形式提供的。單克隆抗體是在腹水或組織培養(yǎng)液中表達(dá)的，可直接使用或進(jìn)行親和純化。一定要記住，變性蛋白可能無法被天然抗原培育出的抗體所識(shí)別。在某些情況下，可能需要非變性凝膠來進(jìn)行印跡�？贵w以緩沖液和封閉液稀釋，以避免與膜的非特異結(jié)合�？贵w稀釋液通常也包含痕量的吐溫20或另一種去污劑，以防止抗體的非特異聚集。許多發(fā)表的化學(xué)發(fā)光操作需要在封閉液和抗體稀釋液中添加0.1%(v/v)吐溫20。我們必須認(rèn)識(shí)到，高于0.05%(v/v)的濃度有可能從膜上洗掉一些印跡的蛋白質(zhì)。
提高吐溫20去污劑的濃度通常會(huì)降低背景。一種更簡(jiǎn)單且更經(jīng)濟(jì)的策略是降低抗體的濃度，特別是二抗(詳見圖1)�？贵w必須特異針對(duì)目的蛋白，不能與封閉液中的組分交叉反應(yīng)，且應(yīng)該是相對(duì)純凈的。其他蛋白質(zhì)或聚集物形式的雜質(zhì)會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合和背景增高。
免疫檢測(cè)是一種極其靈敏的方法。為了實(shí)現(xiàn)高的信噪比和最高的靈敏度，一抗和二抗的濃度應(yīng)針對(duì)每種情況來優(yōu)化。一般來說，高倍稀釋一抗或降低凝膠上的蛋白上樣量可減少非特異信號(hào)。高倍稀釋酶標(biāo)記的二抗可最大限度降低整體的高背景。
一抗和二抗的最佳濃度也取決于檢測(cè)試劑的靈敏度。高靈敏度的試劑(檢測(cè)到飛克級(jí))與低靈敏度的試劑(檢測(cè)到皮克級(jí))相比，抗體用量可減少20倍。抗體濃度的優(yōu)化取決于檢測(cè)底物的例子如圖13所示。在使用最靈敏的檢測(cè)試劑時(shí)，過量的抗體導(dǎo)致高的非特異性和整體背景增高(左上)。在這種情況下，將一抗稀釋度從1:1,000提高到1:10,000，改善了信噪比。在使用沒那么靈敏的檢測(cè)試劑(中間和最下面一行)時(shí)，抗體需要更為濃縮，以產(chǎn)生相同的信號(hào)。
清洗
清洗印跡，從膜上去除未結(jié)合的抗體，它們可能導(dǎo)致高背景和檢測(cè)不佳。通常使用吐溫20的PBS或TBS稀釋液(0.05% v/v)，特別是當(dāng)抗體制劑是粗制的，或高濃度使用時(shí)。如前所述，濃縮的去污劑溶液可能導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)從膜上洗脫。對(duì)于高度純化的抗體，往往只使用緩沖液進(jìn)行清洗。
所需的清洗次數(shù)最好根據(jù)實(shí)驗(yàn)來確定。清洗太少會(huì)產(chǎn)生過多的背景，而清洗過度有可能洗脫抗體并降低信號(hào)。建議至少清洗三次，每次5分鐘。
在TBS清洗液中添加最多0.5M NaCl和0.2% SDS，并將清洗時(shí)間延長(zhǎng)至2小時(shí)，可降低頑固的背景。
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影響檢驗(yàn)結(jié)果的因素
1、試劑和設(shè)備。
一般來說，在免疫檢驗(yàn)的實(shí)際操作過程中，檢測(cè)人員首先應(yīng)選擇合適的檢測(cè)設(shè)備和試劑，否則會(huì)對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。其次，要求檢驗(yàn)人員熟悉質(zhì)量控制，比如，要提前對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，嚴(yán)格控制試劑質(zhì)量，保證試劑的良好性能等。否則可能會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果中出現(xiàn)大量偏差，影響免疫分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2、樣本因數(shù)。在樣品采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等眾多環(huán)節(jié)中，存在影響免疫測(cè)定質(zhì)量的潛在因素。其中，標(biāo)本采集是最基本的因素之一。采集血樣時(shí)，采集時(shí)間不合理或采集姿勢(shì)不規(guī)范，檢測(cè)結(jié)果將受到影響；在樣品運(yùn)輸過程中，操作失誤會(huì)破壞樣品的有效性，大大降低了檢驗(yàn)質(zhì)量。另外，當(dāng)存儲(chǔ)樣品時(shí)，過高或過低的溫度都會(huì)使樣品無效，使得測(cè)試結(jié)果的質(zhì)量難以保證。在樣品檢測(cè)過程中，如果檢測(cè)器不能有效地處理樣品的干擾因素，不僅不利于免疫分析的順利進(jìn)行，而且使檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性無法保證。
3、檢查人員因素。作為免疫檢測(cè)分析的執(zhí)行者，免疫分析顯得尤為重要。專業(yè)技能和綜合素質(zhì)水平，以及技術(shù)的熟練程度，與免疫測(cè)試結(jié)果都密切相關(guān)。
保證檢驗(yàn)準(zhǔn)確的措施
1、加強(qiáng)設(shè)備的維護(hù)和管理，嚴(yán)格保證試劑質(zhì)量，已成為免疫分析的重要組成部分。在實(shí)際的免疫測(cè)定過程中，使用的設(shè)備和試劑必須是已得到主管部門的批準(zhǔn)，并獲得相應(yīng)的.生產(chǎn)許可證的。檢驗(yàn)人員應(yīng)根據(jù)相關(guān)條件的要求儲(chǔ)存試劑，對(duì)免疫分析儀器和設(shè)備進(jìn)行日常維護(hù)和管理，定期檢查和糾正其準(zhǔn)確性，保證檢測(cè)儀器的一致性。如果檢查員發(fā)現(xiàn)儀器有偏差，應(yīng)立即調(diào)整。目前中國(guó)市場(chǎng)上有許多免疫分析試劑存在一定差異，在選擇試劑時(shí)，檢驗(yàn)人員應(yīng)仔細(xì)選擇，確保其性能和質(zhì)量符合檢驗(yàn)要求，以避免后續(xù)檢驗(yàn)中不合格試劑造成的誤差。在特殊情況下如果根據(jù)需要更換試劑，檢查員還應(yīng)進(jìn)行比較試驗(yàn)。在儲(chǔ)存階段，要勤檢查試劑是否在有效期內(nèi)，另外要為試劑提供合適的環(huán)境，防止試劑失效影響檢測(cè)結(jié)果。
2、合理選擇試驗(yàn)方法和正常上限。當(dāng)測(cè)試用于相同目的時(shí)，通常有多種可選擇的測(cè)定方法，但是，并非所有的測(cè)試方法都符合實(shí)際要求。因此，在比較試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，檢測(cè)者需要選擇更可行的免疫分析方法，以確保測(cè)試結(jié)果能真實(shí)反映患者實(shí)際狀況。
3、在采集血樣前，需提前告知受測(cè)者相關(guān)注意事項(xiàng)，如采集血樣前12小時(shí)內(nèi)要保持良好的飲食習(xí)慣和休息模式；采集空腹血樣不能吃早餐等。采集血樣時(shí)，指導(dǎo)受測(cè)者保持正確的姿勢(shì)。采集過程中，選擇高品質(zhì)的穩(wěn)定劑或抗凝劑。對(duì)于用于藥物檢測(cè)的血液樣本，收集時(shí)間和地點(diǎn)的變化將直接影響檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量，因此應(yīng)特別注意采血過程。
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