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探討N�；蛏┎⑧邕虬奉愌苌锏脑O(shè)計論文
20 世紀(jì)中葉以來, 隨著老年人口的快速增加及老年癡呆癥發(fā)病率的增高, 老年癡呆癥的防治已成為全球關(guān)注熱點。老年癡呆癥病人的平均生存期為5～10 年, 老年癡呆癥是老年人群中僅次于心臟病、惡性腫瘤和中風(fēng)的第4 位死亡原因。臨床上老年癡呆有3種: 一是老年性癡呆, 又名阿爾茨海默病 (Alzheimer’sDisease, AD); 二是血管性癡呆, 主要是由腦血管病引發(fā)的癡呆, 包括多發(fā)性梗死或出血灶所致的老年癡呆; 三是混合型癡呆, 指既有老年性癡呆, 又有血管性癡呆或其他類型的癡呆。其中以AD 最為常見。許多研究都證明AD 患者的認(rèn)知功能障礙跟他們的前腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)受損有關(guān)系，從而認(rèn)為患AD 病的主要原因是腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)受到損害, 因此Bartus 等提出“膽堿能假說”: 前腦膽堿能神經(jīng)元系統(tǒng)的神經(jīng)傳遞缺陷與大腦皮質(zhì)、海馬體及其他部位膽堿能遞質(zhì)的缺失, 引起乙酰膽堿基轉(zhuǎn)移酶 (ChAT)和乙酰膽堿酯酶 (AChE) 活性降低, 使乙酰膽堿(ACh) 濃度降低, 這是AD 患者認(rèn)知功能損害的主要原因。大量學(xué)者認(rèn)為增強膽堿能活性的藥物可以改善AD 患者的學(xué)習(xí)記憶能力。中樞膽堿能遞質(zhì)在學(xué)習(xí)與記憶中起著重要的調(diào)節(jié)作用。神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿 (ACh) 的降低是AD 最主要的特征。目前治療AD 的主要藥物為抑制乙酰膽堿酯酶降解的乙酰膽堿酯酶抑制劑, 現(xiàn)在用于臨床上治療AD的主要藥物有他克林 (tacrine)、多奈哌齊 (donepezil)、加蘭他敏 (galantamine)、利斯的明 (rivastigmine)、石杉堿甲 (huerzine A) 和美曲磷酯 (metrifonate)。由于這些藥物只能緩解輕、中度AD 患者的病情, 不能從根本上治愈, 對重癥AD 的患者的治療也沒有顯著的療效。因此, 迫切需要研發(fā)新的高效、低毒的AD藥物。本實驗室近來合成了一個新化合物I,在抑制AChE 活性方面有一定的效果。硫色滿酮是合成雜環(huán)化合物的常用試劑, 它們是一類含有硫原子的雜環(huán)化合物, 以多種形式存于天然產(chǎn)物中, 有較強的生物活性。近年來, 人們將此類化合物應(yīng)用于AD治療領(lǐng)域中, Rampa 等[10]用硫色滿酮和利斯的明結(jié)構(gòu)中的氨基甲酸酯藥效基團(tuán)通過長碳鏈拼接, 合成了具有AChE 抑制活性的硫色滿-4-酮類衍生物, 以此類化合物為基礎(chǔ)的乙酰膽堿酯酶抑制劑的合成研究成為了目前的一個熱點�；衔颕 的活性弱于對照藥多奈哌齊, 因此對結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化, 將苯基噻唑的開環(huán)結(jié)構(gòu)關(guān)環(huán)來考察其乙酰膽堿酯酶的抑制活性。本文在化合物I 的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上, 以硫色滿-4-酮代替苯乙酮, 合成了一系列N-酰基硫色烯并噻唑-2-胺類衍生物II, 并考察了它們對AChE 的抑制作用,為新的乙酰膽堿酯酶抑制劑的開發(fā)做探索性研究。具體反應(yīng)過程見合成路線1。
結(jié)果與討論
1 目標(biāo)化合物的合成
合成的化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR、MS、元素分析及IR 得以確證, 理化數(shù)據(jù)。
2 乙酰膽堿酯酶體外抑制活性
合成化合物的體外AChE 抑制活性實驗表明,制備的18 個化合物均有一定的體外抑制乙酰膽堿酯酶的活性 (如表3 所示)。其中10a 表現(xiàn)出較好的AChE 抑制活性, 其IC50 分別為7.96 μmol·L1 和7.88μmol·L1, 取其平均值為7.92 μmol·L1, 其活性高于對照藥利斯的明, 但低于對照藥多奈哌齊。從合成的化合物的活性數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)不同取代基與生物活性的部分相互關(guān)系如下: 在A 處,苯環(huán)上R1 取代基對生物活性的影響: F、Cl、CH3 的活性依次增強, 例如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 11a (R1=CH3) > 5a (R1=Cl) > 8a (R1=F)。在B 處,酰基碳鏈R2 上多了一個碳原子, 抑制酶的效果明顯增強, 例如表3 中化合物的IC50 的活性大小為: 6a(R2=CH2CH2) > 5a (R2=CH2), 這說明酰胺N 上碳鏈的長短對抑制活性起著重要的影響。在C 處, R3 上的取代基丙基代替了乙基, 活性減弱, 如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 4a (R3=(CH2)2) > 5a (R3=(CH2)3)。在D 處, 叔胺上的R4 取代基二甲氨基對生物活性的影響要比二乙氨基大, 如表3 中化合物的IC50 活性大小為: 4a (R4=CH3) > 4b (R4=CH2CH3)。
實驗部分
所有實驗材料除另作說明外, 均為市售。乙酰膽堿 (電鰻) 購自Sigma 公司。用SGW X-4 顯微熔點儀測定熔點 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)。1H NMR由Bruker AVANCE600 核磁共振儀 (CDCl3 為溶劑, TMS 做內(nèi)標(biāo)) 測定。高分辨質(zhì)譜由Bruker apex ultra7.0 T 傅里葉變換型質(zhì)譜儀測定; 紅外光譜采用FTIR-8400S 傅里葉變換紅外分光光度計。96 孔板讀取用1420 Victor 酶標(biāo)儀。
1 化合物的合成
1.1 化合物1～3 的合成 (以1 合成為例)
取5.94 g(30 mmol) 6-氯硫色滿-4-酮置于250 mL 圓底燒瓶中,加入冰醋酸30 mL 使之完全溶解, 取5.21 g (33 mmol)液溴置于加有適量冰醋酸的恒壓漏斗中。溫度控制在40 ℃, 將溴的冰醋酸溶液緩慢滴加到上述圓底燒瓶中, 控制滴加速度 (每分鐘20 滴), 50～60 min 滴加完畢, 繼續(xù)在40 ℃下反應(yīng)3～4 h。反應(yīng)完畢后靜置,冷卻至室溫。向上述體系中加入飽和亞硫酸氫鈉溶液,有大量絮狀沉淀析出, 抽濾, 濾餅用大量水洗至中性。室溫干燥后得到淡黃色固體3-溴-6-氯硫色滿-4-酮。取3.04 g (40 mmol) 硫脲置于250 mL 圓底燒瓶中, 加入70 mL 無水乙醇, 加熱回流。待硫脲完全溶解后, 取5.52 g (20 mmol) 3-溴-6-氯硫色滿-4-酮, 分批加入反應(yīng)體系中, 反應(yīng)1 h 后停止反應(yīng), 靜置冷卻。減壓下旋干溶劑, 向殘余物中加入飽和碳酸氫鈉溶液, 至pH 值為8～9, 然后用二氯甲烷萃取3～4 次,合并有機相。減壓下旋干有機溶劑, 剩余物經(jīng)硅膠色譜柱 (洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚, 體積比1∶2) 分離純化得到黃色固體3.04 g。用類似的方法得到化合物2、3, 物理和光譜數(shù)據(jù)。
1.2 化合物4～12 的合成 (以4 合成為例)
取2.58 g(10 mmol) 2-[4-(2-溴乙氧基)苯基]乙酸和3.04 g (12mmol) 的1 溶于50 mL 二氯甲烷中, 然后加入3.85 g(12 mmol) TBTU, 常溫下反應(yīng)過夜。反應(yīng)完后將體系中的溶劑旋干, 剩余物經(jīng)硅膠色譜柱 (洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚, 體積比1∶4) 分離純化得到黃色固體3.80 g。用類似方法合成化合物5～12, 物理和光譜數(shù)據(jù)見表4 和表5。
1.3 化合物4a～12a 和4b～12b 的合成 (以4a 合成為例)
取1.98 g (4 mmol) 的化合物4 溶于乙腈, 加入0.53 g (4.8 mmol) 二甲胺鹽酸鹽、1.1 g (8 mmol)碳酸鉀和0.88 g (8 mmol) 碘化鉀, 加熱回流 (80 ℃),反應(yīng)2 h 后停止, 靜置冷卻。然后旋干溶劑, 用飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH 到8～9 左右, 用二氯甲烷萃取3～4 次, 合并有機相, 旋干溶劑。剩余物經(jīng)硅膠色譜柱 [洗脫劑為乙酸乙酯與石油醚 (含1% 的三乙胺), 體積比1∶1] 分離純化得到棕色固體1.25 g。用類似方法合成化合物5a～12a 和4b～12b。
2 體外AChE 抑制試驗
采用Ellman 分光光度法在體外考察化合物對電鰻乙酰膽堿酶的抑制作用, 同時用空白組, 利斯的明、多奈哌齊為陽性對照組進(jìn)行實驗。配置Tris 緩沖液pH 為7.2, 底物ACTI (碘化硫代乙酰膽堿) 的濃度為0.6 mmol稬1, 顯色劑DTNB 的濃度為3 mmol稬1,電鰻AChE 總量為0.035 U, 抑制劑的配置濃度分別為1?105、1?106、1?107、1?108、1?109 mol稬1。分別取20 μL Tris 緩沖液、10 μL 電鰻AChE、10 μL各濃度的抑制劑于96 孔板中, 37 ℃下保溫12 min, 然后加入10 μL 底物ACTI 和50 μL 的顯色劑DTNB,5 min 后使用1420Victor 多標(biāo)計數(shù)儀在405 nm 處讀取每孔吸光度�？瞻捉M用10 μL Tris 緩沖液分別代替底物和抑制劑, 標(biāo)準(zhǔn)組用10 μL Tris 緩沖液代替抑制劑, 每個化合物在不同濃度均實驗3 次, 然后以抑制率I (I = 100?(A 測A 空)/(A 標(biāo)A 空)%) 對抑制劑濃度C作圖, 進(jìn)行S 型曲線線性擬合, 得到半數(shù)抑制率IC50對應(yīng)的濃度Cx, 為了得到準(zhǔn)確的IC50, 從1?105～1?109 mol稬1 中選擇最接近Cx 的濃度1?10xmol稬1, 且1?10x mol稬1 小于Cx。配制1?10x、3?10x、5?10x、7?10x、9?10x mol稬1, 同法操作酶抑制實驗, 然后以抑制率I 對抑制劑濃度C 作圖,進(jìn)行直線線性擬合, 求出IC50。
3 小結(jié)
合成的大部分的N-酰基硫色烯并噻唑-2-胺類化合物都有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性, 化合物10a 的生物活性是其中最好的, 其IC50 值達(dá)到了7.92μmol·L1, 活性優(yōu)于對照藥物利斯的明。這說明N-酰基硫色烯并噻唑-2-胺類化合物的結(jié)構(gòu)值得進(jìn)一步研究。
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