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甘草水制廣地龍飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
【摘要】 目的 建立甘草水制廣地龍飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 按2005年版《中國藥典》附錄ⅨH水分測定法中的第一法、附錄ⅨK灰分測定法和附錄ⅩA浸出物測定法測定;采用HPLC法測定飲片中的次黃嘌呤和肌苷的含量。結(jié)果 甘草水制廣地龍飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：水分含量≤5.0%，總灰分含量≤10.0%，酸不溶性灰分含量≤5.0%，水溶性浸出物濃度≥20.0%，乙醇浸提物濃度≥8.0%;次黃嘌呤含量≥0.006%，肌苷含量≥0.40%。結(jié)論 建立了較完善的甘草水制廣地龍飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，改變了過去僅依靠經(jīng)驗和感官判斷的鑒定方法。
【關(guān)鍵詞】 甘草水制廣地龍;水分測定;灰分測定;浸出物測定;次黃嘌呤;肌苷
Study on quality standard for the liquorice processed Pheretima aspegillum
TAN Jun?ying1,XIE Yuan2,KE Xiao?yan2,LI Zhong2,3
(1.The First Affinity Hospital, Hunan University of Tradition Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410007,China; 2.School of TCM, Guangdong Pharmaceutical College, Guangzhou,Guangdong 510006,China;
3.Department of pharmaceutics, Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha,Hunan 410208,China)Abstract:Objective To establish a quality standard for the liquorice processed Pheretima aspegillum.Methods Samples were determined according to the procedures recorded in the Appendix ⅨH, ⅨK and ⅩA of Chinese Pharmacopoeia(2005), for moisture, ashes and extracts determination respectively, and the content of hypoxanthine and inosine was determined by HPLC.Results Temporary quality standards were established that the moisture in P. aspegillum should be less than 5.0%, with the total ashe content below 10.0%, acid insoluble ashe content lower than 5.0%, the content of water extract higher than 20.0%, and the ethanol extract should be higher than 8.0%, hypoxanthine higher than 0.006%, and inosine higher than 0.40%.Conclusion This research changed traditional methods of judging quality based on experiences and senses, and established a good quality standard for the liquorice processed P. aspegillum.
Key words:liquorice?processed Pheretima aspegillum; moisture determination; ashes determination; extract determination; hypoxanthine; inosine
廣地龍是鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓 Pheretima aspegillum (E.Pettier)的干燥體，主產(chǎn)于廣東和廣西，為廣東的道地藥材[1]。其性咸寒，有清熱、平肝、正喘、通絡(luò)之功效，主治高熱狂躁、驚風(fēng)抽搐、風(fēng)熱頭痛、目赤、中風(fēng)半身不遂、喘息等疾病[2]。歷代醫(yī)家所用的地龍炮制品眾多，在廣東及香港現(xiàn)廣泛應(yīng)用甘草水制廣地龍飲片，其目的是使其質(zhì)地松脆、增效減毒、矯臭矯味以便于煎制服用。近代研究發(fā)現(xiàn)次黃嘌呤是廣地龍平喘主要有效成分之一，有擴(kuò)張支氣管作用，并能對抗組胺及毛果蕓香堿引起的支氣管收縮發(fā)揮平喘作用[3]。肌苷又稱為次黃嘌呤核苷，在酸性及高溫條件下容易分解為次黃嘌呤等有關(guān)物質(zhì)[4]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)：廣地龍越粗壯，其飲片中的肌苷含量越高[5]。2005年版《中國藥典》中“地龍”的[炮制]項下只收錄了生地龍一種，且地龍的常規(guī)檢查項目下沒有收載醇溶性浸出物檢查和有效成分的含量測定。目前尚未制定甘草水制廣地龍的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)多為對廣地龍飲片中的琥珀酸[6]和次黃嘌呤等成分[7～9] 進(jìn)行含量測定, 甘草水制廣地龍飲片的質(zhì)量控制仍停留在經(jīng)驗或古法的基礎(chǔ)上。因此，為了保證甘草水制廣地龍這種地方習(xí)用炮制品的質(zhì)量，本實驗采用常規(guī)檢查結(jié)合HPLC法測定飲片中的次黃嘌呤和肌苷含量的方法，對甘草水制廣地龍飲片進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。
1 儀器與試藥
廣地龍為博羅先鋒藥業(yè)廣地龍GAP基地提供，經(jīng)廣東藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為鉅蚓科動物參環(huán)毛蚓Pheretima aspegillum(E.Pettier)的干燥體;甘草為市售藥材，經(jīng)廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院劉基柱副教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根。炮制品由本實驗室加工，標(biāo)本保存在廣東藥學(xué)院藥用植物與中藥鑒定學(xué)教研室。次黃嘌呤對照品(140661?200402)與肌苷對照品(140669?200401)均購于中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜醇;水為超純水;其它試劑為分析純。
高效液相色譜儀(上海天美Organizer LC 2050; UV Detector LC2010;Pump LC2130);DL?360A超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司，59 kHz,250 W); 101?3A電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(上海迅能電熱設(shè)備有限公司)。
2 方法與結(jié)果
2.1 炮制品的制備 將廣地龍飲片用10%的甘草水悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火炒干，炒至廣地龍表面成棕色，取出，放涼。
2.2 性狀鑒別 呈薄片狀，長3～4 cm，寬約1 cm，邊緣略卷。具環(huán)節(jié)，背部棕褐色至紫灰色，腹部淺黃棕色;生殖帶較光亮。體輕，略呈革質(zhì)，質(zhì)韌不易折斷。氣腥，味微甘、咸。
2.3 顯微鑒別 粉末棕黃色。表皮細(xì)胞為黃棕色，細(xì)胞界限不明顯，有暗棕色的色素顆粒散在。肌纖維多，為透明或淡棕色，直徑大約6～28 μm，大多離散，細(xì)長，多彎曲，有的局部膨大，明暗相間紋理不明顯。剛毛少見，常破碎散在，淡棕色或黃棕色，中部直徑大約28～33 μm，先端多鈍圓，有的表面可見縱裂紋，偶見皮樣紋理。
2.4 薄層鑒別 同《中國藥典》2005年版“地龍”藥材項下[1]方法。
2.5 常規(guī)檢查[1]
2.5.1 水分測定 甘草水制廣地龍飲片中揮發(fā)性成分較少，故采用《中國藥典》2005年版一部(附錄Ⅸ H第一法)測定。
2.5.2 總灰分、酸不溶性灰分測定 按《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅨK)方法測定。
2.5.3 浸出物測定 按《中國藥典》2005年版一部(附錄ⅩA)浸出物測定法測定。包括水溶性浸出物測定和醇溶性浸出物測定。供試品需粉碎，使能通過二號篩，并混合均勻，醇溶性浸出物測定采用冷浸法,乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%。以上常規(guī)檢查項目結(jié)果見表1。根據(jù)實驗結(jié)果分析，建議在制定甘草水制廣地龍飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，以含水量不超過5.0%，總灰分不超過10.0%，酸不溶性灰分不超過5.0%，水溶性浸出物不得少于20.0%，醇溶性浸出物不得少于8.0%為宜。表1 甘草水制廣地龍飲片常規(guī)檢查項目結(jié)果論文下載
2.6 含量測定
2.6.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(ODS?EP,4.6 mm×250 mm, 5 μm,迪馬公司);甲醇?水(體積比95:5)為流動相;檢測波長為249 nm[5];柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按次黃嘌呤峰計算，不低于3 800，在此條件下測得次黃嘌呤、肌苷與相鄰組分分離度良好。分別精密吸取次黃嘌呤對照品溶液、肌苷對照品溶液與供試品溶液各10 μL，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，見圖1
2.6.2 對照品儲備溶液的制備 分別精密稱取次黃嘌呤對照品和肌苷對照品適量，加流動相配制成1 μg·mL-1 的次黃嘌呤對照品儲備溶液、100 μg·mL-1的肌苷對照品儲備溶液。
2.6.3 供試品溶液的制備[5] 精密稱取樣品2.0 g，置具塞錐形瓶中，加水50 mL，密塞，浸泡1 h，超聲30 min，殘渣再加水50 mL提取1次，合并提取液，離心10 min(4 000 r·min-1)。精密量取提取液1 mL，用流動相定容至10 mL，濾過，即得。
2.7 方法學(xué)考察
2.7.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取次黃嘌呤對照品儲備溶液0.2、0.4、1.2、1.6、2 mL置10 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻;分別精密吸取肌苷對照品儲備溶液0.4、0.5、0.6、1.0、1.2、1.5 mL置10 mL量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻。分別取上述溶液各10 μL，進(jìn)樣，按“2.6.1”項下色譜條件進(jìn)行分析。以質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo),峰面積(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:
次黃嘌呤A =3×10-6ρ-0.0108，r=0.999 2，進(jìn)樣量在0.020 8～0.208 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。肌苷A = 5×10-5ρ+0.2665，r=0.999 4，進(jìn)樣量在4.004～15.015 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.7.2 精密度試驗 取同一對照品溶液,重復(fù)進(jìn)樣6次,每次10 μL,根據(jù)峰面積計算含量，次黃嘌呤和肌苷的RSD分別為1.53%、1.80%,結(jié)果表明本方法精密度良好。
2.7.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.6.3”項下方法制得供試品溶液,按“2.6.1”項下方法于0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣10 μL,根據(jù)峰面積計算含量，次黃嘌呤和肌苷的RSD依次分別為1.70%、1.80%,表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.7.4 重復(fù)性試驗 按“2.6.3”項下方法分別制得供試品溶液6份,按“2.6.1”項下方法進(jìn)行測定,根據(jù)峰面積計算含量,次黃嘌呤和肌苷的RSD分別為1.5%和2.6%，表明本方法重復(fù)性良好。
2.7.5 加樣回收率試驗 取已知含量的廣地龍粉末約1g,精密稱定,共9份，分別精密加入次黃嘌呤和肌苷對照品溶液(次黃嘌呤質(zhì)量濃度為0.100 2 mg·mL-1，肌苷質(zhì)量濃度為2.003 μg·mL-1)適量,按“2.6.3”項下方法制備,依法測定。計算得到次黃嘌呤的平均回收率為96.8%，RSD值為1.78%(n=9);肌苷的平均回收率為103.2%，RSD值為1.43%(n=9)。結(jié)果見表2。表2 次黃嘌呤和肌苷加樣回收率測定結(jié)果
2.8 樣品測定 取甘草水制廣地龍飲片5批，按“2.6.3”項下方法制備供試品溶液，按 “2.6.1”項下條件測定樣品中次黃嘌呤和肌苷的含量，結(jié)果見表3。5批樣品次黃嘌呤的平均含量為0.0069%，肌苷的平均含量為0.4516%。結(jié)合不同批次藥材質(zhì)量存在差異進(jìn)行考慮，暫定按干燥品計算，甘草水制廣地龍中次黃嘌呤含量不得少于0.006%，肌苷含量不得少于0.40%。表3 甘草水制廣地龍飲片中次黃嘌呤和肌苷的含量
3 討論
肌苷在稀酸中易水解產(chǎn)生次黃嘌呤和D?核糖，為考察炮制對次黃嘌呤和肌苷成分的影響，探討其轉(zhuǎn)化機(jī)制，故同時選用兩者作為含量測定指標(biāo)。在本試驗色譜條件下，上述2種成分可得到有效分離。經(jīng)方法學(xué)考察，本方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率試驗均符合有關(guān)規(guī)定，為廣地龍質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化提供了依據(jù)。
建議甘草水制廣地龍飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：水分含量≤5.0%，總灰分含量≤10.0%，酸不溶性灰分含量≤5.0%，水溶性浸出物濃度≥20.0%，乙醇浸提物濃度≥8.0%,次黃嘌呤含量≥0.006%，肌苷含量≥0.40%。
【參考文獻(xiàn)】
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