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過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞凋亡的作用
作者：田英娟，田園，劉超，葉亮
【摘要】 目的 觀察過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞凋亡的誘導作用，并對機制作初步探討。方法 取健康的豬甲狀腺細胞培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的碘化鉀(KI)，觀察細胞的形態(tài)改變；瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞術分析細胞DNA的降解；MDA法測定細胞膜的脂質過氧化程度。結果 加入KI 24h后，熒光染色鏡下觀察可見凋亡細胞；瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀帶；流式細胞術見亞二倍體（凋亡）峰，細胞凋亡率和脂質過氧化產(chǎn)物隨碘化物濃度的升高而升高(P<0.05)。結論 過量碘化物誘導了原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞凋亡，可能通過活性氧機制啟動凋亡。
【關鍵詞】 甲狀腺細胞凋亡；過量碘；活性氧
【Abstract】 Objective To study the effect of excess iodide on the primary cultured pig and its mechnism. Methods We employed the primary cultured pig thyroid cells. The apoptosis was evaluated by AQ-stained fluorescin， DNA ladder by gel electrophoresis and subdiploidy by propidium iodide-stained flow cytometry. The level of lipid peroxide under KI treatment was determined by measuring the production of thiobarbituric acid reactive substances.Results Thyroid cells treated with iodide excess at different concentration underwent apoptosis. Iodide displayed a dose-dependent apoptosis index and a dose-dependent generation of TBARS levels.Conclusion Iodide excess induce the apoptosis in the primary cultured pig thyroid cells. This type of apoptosis seems to be activated by reactive oxygen species.
【Key words】 thyroid cell apoptosis；iodide excess；reactive oxygen species
碘化物在人類的日常生活中具有重要的意義。過量碘化物對甲狀腺及培養(yǎng)的甲狀腺細胞的毒性效應早已證實，近幾十年來從凋亡角度對這種作用作了一些研究［1～3］。目前過量碘化物對體外培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞的作用未見報道，其誘導甲狀腺細胞凋亡的機制尚未闡明。本實驗觀察過量碘化物對原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞凋亡的誘導作用，并對凋亡機制作初步研究。
1 與方法
1.1 主要試劑與儀器 F-12培養(yǎng)基為美國Gibco公司生產(chǎn)，促甲狀腺激素(TSH)、膠原酶為美國sigma公司生產(chǎn)，熒光顯微鏡為日本Olympus BH-2型，流式細胞儀為美國Becton Dickinson公司產(chǎn)品。
1.2 甲狀腺細胞培養(yǎng) 取適量的豬甲狀腺組織(錦州肉聯(lián)廠提供)PBS沖洗，剪碎倒入帶有磁力攪拌子的三角燒瓶中，加入雙酶消化；每隔15～20min取出上2/3的消化液，漂洗制成細胞懸液；消化完畢將細胞懸液通過100目篩網(wǎng)過濾，調整細胞數(shù)106/ml，接種于培養(yǎng)板上；置5%二氧化碳孵箱，在10%FCS、1u/LTSH的F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3天更換培養(yǎng)基。
1.3 實驗分組 甲狀腺細胞正常培養(yǎng)24h后，加入處理因素并分組。空白對照組：不加其他處理因素；陽性對照組：放線菌酮（CHX）2×10-3g/L(終濃度)；陰性對照組：氯化鉀60mmol/L(終濃度)；實驗組：不同濃度的KI。所用濃度根據(jù)多次預實驗的結果并參考文獻資料［1］。
1.4 甲狀腺細胞的形態(tài)學觀察 在倒置顯微鏡下，觀察各組培養(yǎng)細胞的形態(tài)及生長狀況。培養(yǎng)24h后加入處理因素，再過24h收集細胞，經(jīng)吖啶橙（AO）染色在熒光顯微鏡下觀察。
1.5 瓊脂糖凝膠電泳 取實驗組（KI 1mmol/L，60mmol/L， 100mmol/L）、陰性對照組、陽性對照組同時做電泳。加入處理因素再培養(yǎng)24h后收集細胞，分別加入細胞裂解液、RNA酶、樣品緩沖液混勻后，加樣于1%瓊脂糖凝膠的樣品孔，電泳結束觀察并記錄。
1.6 細胞凋亡率和脂質過氧化測定 實驗設6個不同的濃度組，加入KI再培養(yǎng)24h后收集細胞。用預冷的70%乙醇固定細胞，加入碘化丙啶（PI）染液后，流式細胞儀分析各組細胞DNA的含量分布；超聲震碎細胞，按南京建成生物公司提供的方法檢測MDA含量。亞二倍體峰（凋亡）細胞比率表示細胞的凋亡率。
1.7 學分析 實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，應用統(tǒng)計軟件SPSS11.5進行單因素方差分析。
2 結果
2.1 甲狀腺細胞的形態(tài)學觀察 甲狀腺細胞是腺體上皮細胞，20～24h貼壁生長，細胞呈多邊形、圓形；２～3天可見典型的濾泡結構，5～6天細胞鋪滿單層。加入KI ６～8h濾泡結構開始改變，細胞有分散傾向；24h后無典型濾泡結構，有的細胞變小、變圓，核內出現(xiàn)碎片；48h后可見漂浮的細胞，以后改變不明顯。
2.2 細胞凋亡的熒光顯微鏡觀察 陽性對照組及實驗組的凋亡細胞核內可見致密濃染的黃綠色染色，呈圓形、月牙形，可見發(fā)泡現(xiàn)象及凋亡小體。陰性對照組細胞核內呈均勻的黃綠色染色。
2.3 瓊脂糖凝膠電泳 電泳結果顯示：陽性對照組、KI組見明顯的凋亡條帶，呈云梯狀；高濃度的梯狀帶較明顯。陰性對照組無云梯狀帶(見圖1)。
2.4 細胞凋亡率測定 流式細胞儀分析表明在不同KI濃度組DNA直方圖上顯示：隨濃度的升高二倍體峰（G0/ G1期）細胞減少（P<0.05），亞二倍體峰（凋亡）細胞升高（P<0.05）。見表1。
2.5 脂質過氧化程度測定 培養(yǎng)細胞加入過量的KI后，脂質過氧化產(chǎn)物MDA的量隨濃度的升高而升高（P<0.05）。見表2。
表1 在不同濃度KI作用下凋亡細胞（Ap）、G0／G1細胞所占比率 （%，±s）
注：不同濃度的KI組間比較，*P<0.05，△P＞0.05
表2 不同濃度碘化鉀作用下MDA含量 （nmol/mg，±s）
注： 不同濃度的碘化鉀組間比較，*P<0.05
2.6 相關性分析 從培養(yǎng)甲狀腺細胞的細胞脂質過氧化產(chǎn)物MDA與細胞凋亡率的散點圖上可見，細胞脂質過氧化水平與細胞凋亡率呈顯著正相關，r=0.993，P<0.01。
3 討論
自然界中與甲狀腺激素合成有關的碘主要是碘化鈉、碘化鉀。碘化物在人類的日常生活中具有重要的意義，但過量碘化物對在體甲狀腺組織及培養(yǎng)的甲狀腺細胞都存在毒性效應［1～4］。本實驗豬甲狀腺細胞培養(yǎng)24h，加入過量碘化鉀，甲狀腺濾泡及細胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細胞發(fā)生凋亡，反映了過量碘化物的細胞毒性效應。過量碘化物的這種毒性效應機制至今尚未闡明。
細胞壞死和凋亡是細胞兩種截然不同的死亡方式，但在某些情況下二者的區(qū)分較困難，尤其對培養(yǎng)細胞。當以細胞凋亡誘導劑進行凋亡誘導時，開始細胞以凋亡為特征，隨著誘導時間的延長或誘導劑濃度的增加，凋亡后期的細胞發(fā)生繼發(fā)性死亡的改變，稱為細胞凋亡性壞死，即凋亡細胞出現(xiàn)腫脹、空泡化，甚至胞膜發(fā)生破裂［5］。過量碘化物引起培養(yǎng)甲狀腺細胞形態(tài)、超微結構、電位的改變，是細胞凋亡在不同階段的表現(xiàn)形式［1～4］。Vitale等研究過量碘化鉀對體外培養(yǎng)的甲狀腺TAD-2細胞系及人正常甲狀腺細胞的作用，認為在實驗中出現(xiàn)的甲狀腺細胞凋亡和壞死，是一個細胞凋亡的過程，壞死是細胞凋亡性壞死［1］。本實驗中過量碘化鉀誘導了原代培養(yǎng)的豬甲狀腺細胞凋亡；且細胞凋亡率隨濃度的升高而上升，呈劑量依賴關系，與Vitale的報道相符。
人們早已發(fā)現(xiàn)丙基硫氧嘧啶、甲硫咪唑、高氯酸等抑制過量碘化物對甲狀腺細胞的毒性作用，阻滯細胞的壞死和凋亡［1，4］。推斷碘離子的代謝過程可能與碘化物誘導的細胞凋亡有關。甲狀腺濾泡上皮細胞可濃縮I-，過氧化物酶在氧化I-過程中生成活性很高的自由基引起質膜中脂質過氧化，導致線粒體內活性氧的產(chǎn)生并釋放，誘導細胞凋亡。本實驗中MDA、細胞凋亡率均隨碘化物濃度的升高而升高，推測加入過量碘化鉀后，質膜中脂質過氧化導致活性氧的釋放，誘導培養(yǎng)的甲狀腺細胞凋亡，其途徑可能通過活性氧機制。過量碘化物誘導的甲狀腺細胞凋亡的過程中，檢測到的細胞色素C、活性 氧、Caspase酶、Bcl家族蛋白提示了線粒體在這種細胞凋亡中可能起重要的作用［1，2，6］。
從左到右陰性對照組、陽性對照組、實驗組(KI1、60、100mmol/L)?
圖1 對照組、陽性組及實驗組瓊脂糖凝膠電泳結果
【參考文獻】
1 Vitale M， Di Matola T， Dascoli F， et al. Iodide excess induces apoptosis in thyroid cells though a p53-independent mechanism involving oxidative stress.Endocrinology， 2000，141(2)： 598-605.
2 楊長春，尹桂山，崔靈光，等. 高碘對豚鼠腦和甲狀腺細胞凋亡及調節(jié)基因的影響. 中華雜志， 2000，141（2）：598-60.
3 Mutaku JF， Poma JF， Many MC， et al. Cell necrosis and apoptosis are differentially regulated during goiter development and iodine-induced involution. J Endocrinol， 2002，172(2)： 375-386.
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6 Di Matola T， D’Ascoli F， Fenzi G， et al. Amiodrone induces cytochrome C realse and apoptosis through an iodine-independent mechanism. J Clin Endocrinol Metab， 2000，85(11)： 4323-4330.
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