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中藥對(duì)鎳暴露氧化損傷抑制作用
作者：呂曉云，蒲曉麗，陳靜，朱玉真，趙健雄，魏虎來
【摘要】 目的 研究灌服扶正解毒湯(FJD)后兔血清對(duì)硫酸鎳(NiSO4)暴露的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)自由基含量及8?羥基?2?脫氧鳥苷三磷酸酶(8?oxo?dGTPase)表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)的16HBE細(xì)胞分別經(jīng)NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒湯含藥血清共同處理后，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)及實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR檢測(cè)自由基含量及8?oxo?dGTPase表達(dá)的變化。結(jié)果 NiSO4(800μmol/L)暴露的16HBE細(xì)胞，其自由基含量及8?oxo?dGTPase表達(dá)水平均高于NiSO4與扶正解毒湯(10%)共處理組細(xì)胞，Ｐ＜0?05～0?01，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＞2%。結(jié)論 8?oxo?dGTPase可作為鎳暴露氧化應(yīng)激的標(biāo)記物；中藥扶正解毒湯通過清除自由基，下調(diào)8?oxo?dGTPase的表達(dá)，對(duì)鎳暴露氧化損傷具有顯著的抑制作用。
【關(guān)鍵詞】 扶正解毒湯
本課題組多年進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及職業(yè)病研究表明，中藥扶正解毒湯(FJD)具有良好地拮抗鎳毒性的作用〔1，2〕。本文從體外途徑研究了中藥解毒湯對(duì)硫酸鎳(NiSO4)暴露的人支氣管上皮(16HBE)細(xì)胞內(nèi)自由基含量及8?羥基?2?脫氧鳥苷三磷酸酶(8?oxo?dGTPase)表達(dá)的影響，旨在為該復(fù)方的作用機(jī)制補(bǔ)充新的資料。
1 與方法
1?1 材料
1?1?1 細(xì)胞及動(dòng)物16HBE細(xì)胞(美國(guó)ATCC公司)。純種青紫蘭兔8只，雄性，體重(2?1±0?3)kg(中國(guó)蘭州生物制品研究所)，合格證號(hào)：14?004，常規(guī)飼養(yǎng)。
1?1?2 中藥 扶正解毒湯由紅芪、當(dāng)歸、丹參、枸杞等組成，以三蒸水煎煮，過濾、濃縮成含生藥4g/ml的溶液，高溫高壓消毒滅菌，密封，4℃以下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/P>
1?1?3 主要試劑及設(shè)備 基礎(chǔ)培養(yǎng)液(MEM)培養(yǎng)基、Trizol試劑盒(美國(guó)GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；乙酰乙酸鹽?2，7?二氯氫化熒光素(D?399)(美國(guó)Molecular Probes公司)；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)；TCS sp2型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(德國(guó)Leica公司)；Smart Cycler ⅡSystem熒光定量PCR儀(美國(guó)PE公司)。人類human NutT homologue (hMTH1)基因PCR引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)〔３〕。分別為P1：5′?CTTCTCTGCGCCACTCAA?3′，P2：5′?GAGCGGCGGTGCAGAACC?3′；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段177bp。β?actin引物為P1：5′?TTGCGCTCAGGAGCAAT?3′，P2：5′?TTCCAGCCTTCCTTCCTGG?3′；預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段223bp(寶生物工程有限公司合成)。
1?2 方法
1?2?1 扶正解毒湯血清凍干粉制備 以中藥扶正解毒湯12g/kg每天分2次給兔等體積灌胃，空白對(duì)照組予以生理鹽水(灌胃前均禁食，自由取水)，共3d。于末次灌胃后2h心臟采血，按文獻(xiàn)〔4〕方法制備扶正解毒湯血清及空白血清凍干粉。
1?2?2 細(xì)胞培養(yǎng)及受試物處理 16HBE細(xì)胞用含10%小牛血清、青霉素及鏈霉素的MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO２飽和濕度的中培養(yǎng)。試驗(yàn)時(shí)以不含小牛血清的MEM培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)至1×104/ml，按以下分組分別處理：(1)NiSO4組：NiSO4以無血清MEM培養(yǎng)液溶解，終濃度800μmol/L(預(yù)試驗(yàn)中，NiSO4≥800μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率驟降至60%以下，故以800μmol/L作為此試驗(yàn)濃度)。(2)扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒湯血清，終濃度為10%(體積分?jǐn)?shù))，再加入NiSO4(800μmol/L)。(3)扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組：同時(shí)加入扶正解毒湯與NiSO4。(4)空白血清對(duì)照(簡(jiǎn)稱空白血清)+NiSO4組：同時(shí)加入空白血清與NiSO4。終濃度均同(2)。(5)空白血清組：加入空白血清(10%)。(6)陰性對(duì)照組：MEM培養(yǎng)液。
1?2?3 細(xì)胞存活率檢測(cè) 以常規(guī)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，每組共計(jì)數(shù)250個(gè)細(xì)胞。
1?2?4 細(xì)胞內(nèi)自由基含量檢測(cè) 在加入NiSO416h后，將收集的各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，取D?399(5μg/ml)1ml，加至各細(xì)胞懸液中，按文獻(xiàn)〔5〕方法以激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)檢測(cè)16HBE細(xì)胞內(nèi)自由基含量(以平均熒光強(qiáng)度表示)。
1?2?5 RNA提取、cDNA合成及標(biāo)準(zhǔn)定量模板的制備 在進(jìn)行自由基含量測(cè)定的同時(shí)，另收集各組細(xì)胞，按Trizol試劑盒說明，提取各組總RNA，測(cè)定A260，A280的吸光度值，計(jì)算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作說明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,置于-80℃保存?zhèn)溆谩毶锕こ逃邢薰緲?gòu)建的hMTH1及β?actin定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒利用各自的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，制備6個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板，分別定義為101～106拷貝數(shù)/μl，-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>
1?2?6 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng) 根據(jù)SYBR? Premix Ex TaqTM試劑盒說明，設(shè)定反應(yīng)擴(kuò)增條件，將6組實(shí)驗(yàn)樣品與不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板同時(shí)進(jìn)行PCR。重復(fù)3次。將檢測(cè)的臨界點(diǎn)設(shè)定在擴(kuò)增過程中，熒光信號(hào)由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle,CT)作為模板初始濃度的間接指標(biāo)，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)模板拷貝的對(duì)數(shù)相應(yīng)的CT值作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1?2?7 8?oxo?dGTPase(hMTH1 mRNA)表達(dá)的相對(duì)定量分析 將得到的各組hMTH1基因及β?actin基因的值分別代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算出各自的起始模板量。以β?actin作為參比基因?qū)λ袠悠愤M(jìn)行RNA校正，用hMTH1基因的定量結(jié)果除以β?actin定量結(jié)果即可得到校正值。以陰性對(duì)照組hMTH1 mRNA的表達(dá)量作為“1”，再根據(jù)校正值計(jì)算出其他各組的相對(duì)量，進(jìn)行組間相對(duì)量的比較。
1?3 分析 采用SPSS 10?0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；組間差異用t及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)檢驗(yàn)(以RSD＞2%為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
2 結(jié)果
2?1 細(xì)胞存活率 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，各組的細(xì)胞存活數(shù)均不低于90%，且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2?2 LSCM檢測(cè)結(jié)果(表1，圖1A～Ｃ) NiSO4染毒后16h，細(xì)胞D?399平均熒光強(qiáng)度(自由基含量)明顯增強(qiáng)，扶正解毒湯血清與NiSO4共處理各組D?399平均熒光強(qiáng)度顯著低于NiSO4組(Ｐ＜0?05～0?01)；空白血清對(duì)染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基含量變化無影響。
表1 扶正解毒湯血清對(duì)染鎳16HBE內(nèi)自由基含量變化的影響（略）
注：與陰性對(duì)照組比較，a Ｐ＜0?05；與NiSO4組比較，b Ｐ＜0?05，c Ｐ＜0?01
A：NiSO4組 B：扶正解毒湯+NiSO4(Ⅰ)組 C：扶正解毒湯+NiSO4(Ⅱ)組
圖1 LSCM下16HBE細(xì)胞內(nèi)D?399熒光強(qiáng)度(×40)（略）
2?3 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 hMTH1和β?actin定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-1?0388和-1?1021，r2分別為0?9990和0?9966。表明線性關(guān)系良好，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)能夠進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
2?4 扶正解毒湯血清對(duì)染鎳細(xì)胞８?oxo?dGTPase(hMTH1 mRNA)表達(dá)的影響(表2) 與陰性對(duì)照組比較，NiSO4染毒組細(xì)胞８?oxo?dGTPase表達(dá)明顯增強(qiáng)(RSD=5?8%)，且空白血清對(duì)此結(jié)果無影響；而扶正解毒湯+NiSO4Ⅰ組、扶正解毒湯+NiSO4Ⅱ組細(xì)胞８?oxo?dGTPase表達(dá)水平則明顯低于NiSO4組(RSD分別為6?7%，6?3%)。
3 討論
�。�?oxo?dGTPase由hMTH1基因編碼，可催化DNA氧化損傷產(chǎn)物8?羥基?2?脫氧鳥苷三磷酸(８?oxo?dGTP)的水解，從而阻止后者向DNA的錯(cuò)誤摻入，減少突變。故被視為一種內(nèi)源性抗氧化、抗突變酶〔6〕，又可作為一種氧化應(yīng)激的標(biāo)記物〔3〕。鎳化合物可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激等途徑產(chǎn)生一系列細(xì)胞遺傳毒性，甚至癌變〔7，8〕。本研究發(fā)現(xiàn)，NiSO4(800μmol/L)暴露16HBE細(xì)胞16h，其自由基含量及８?oxo?dGTPase表達(dá)均明顯增強(qiáng)，間接證實(shí)了鎳暴露16HBE細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的存在，同時(shí)也證明了８?oxo?dGTPase作為氧化應(yīng)激標(biāo)記物的作用。16HBE細(xì)胞經(jīng)扶正解毒湯血清與NiSO4共同處理后，其自由基明顯降低，而８?oxo?dGTPase的表達(dá)水平則無明顯增加。提示扶正解毒湯可能通過或直接清除方式而減少染鎳細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生，發(fā)揮體外抗氧化作用，此與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致〔９，１０〕。同時(shí)亦可認(rèn)為，扶正解毒湯與NiSO4共處理組細(xì)胞內(nèi)８?oxo?dGTPase表達(dá)的下調(diào)，并非扶正解毒湯血清直接作用的結(jié)果，而正是由于扶正解毒湯對(duì)ROS迅速而有效的清除，使得該氧化應(yīng)激標(biāo)記物的“預(yù)警”效應(yīng)處于低或不應(yīng)答狀態(tài)，從而反證了扶正解毒湯的抗氧化作用。有關(guān)扶正解毒湯抗鎳暴露氧化損傷的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。
表2 不同處理組細(xì)胞hMTH1 mRNA表達(dá)的相對(duì)量比較（略）
注：與陰性對(duì)照組比較，a RSD=5?8%；與NiSO4組比較，b RSD=6?7%，c RSD＝6?3%
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