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維生素E對(duì)阿霉素腎毒性抑制作用的研究
【摘要】 目的 探討維生素E(vitamin E，VE)能否抑制阿霉素(doxorubicin, DXR)的腎毒性。方法 用DXR，DXR與VE處理腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(CRL?1927)，通過堿性彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA損傷程度。結(jié)果 10 μmol/L DXR處理細(xì)胞后，彗尾長(zhǎng)度明顯增加。DXR與VE共同處理細(xì)胞后，彗尾長(zhǎng)度與DXR處理細(xì)胞相比明顯變短，并呈時(shí)間、濃度依賴性。結(jié)論 DXR造成了腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷，而VE抑制了DXR的腎毒性作用。
【關(guān)鍵詞】 維生素E 阿霉素 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞
【Abstract】 Objective To investigate whether vitamin E can inhibit the nephrotoxicity of doxorubicin.Methods After DXR with or without vitamin E treated renal mesangial cell (CRL?1927), alkaline comet assay was used to detect DNA damage. Results After 10 μmol/L DXR treated cells, the length of comet tails increased obviously. After DXR and VE treated cells together, the length of comet tails decreased in time and concentration?dependent manner when compared to that of control group. Conclusion DXR induced the damage of renal mesangial cell , VE inhibited the nephrotoxicity of doxorubicin.
【Key words】 vitamin E，doxorubicin( DXR)，renal mesangial cell
維生素E(vitamin E，VE)又稱生育酚，目前自然界有8種，包括α、β、γ與δ生育酚以及α、β、γ與δ生育三烯酚，其中α生育酚的生物活性最大[1]。VE作為脂溶性抗氧化劑，不僅能清除自由基，還能阻斷脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞和組織免受由自由基誘導(dǎo)的氧化損傷[2],維持生物膜的正常結(jié)構(gòu)[3]。環(huán)類抗生素阿霉素(doxorubicin，DXR)，是一種具有細(xì)胞毒性的化療藥物，廣泛地用于各種腫瘤的治療。DXR細(xì)胞毒性在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也導(dǎo)致了正常細(xì)胞組織的損傷，其腎毒性嚴(yán)格地限制了DXR的使用。故本實(shí)驗(yàn)以DXR對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的DNA損傷作用為研究，探討VE是否能抑制DXR的腎毒性。
1 材料與方法
1.1 主要試劑 腎小球內(nèi)皮細(xì)胞CRL?1927購于ATCC。最低必需培養(yǎng)基(Eagle’s minimum essential medium ，MEM )、L?2谷氨酰胺、小牛血清均為美國Gibco 公司產(chǎn)品。VE 、DXR、二甲基亞砜(DMSO)及4’，6?二脒基?2?苯基吲哚(DAPI)均購于Sigma公司。Olympus A×70 熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司，DYY?6C 型電泳儀購自北京市六一儀器廠。
1. 2 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)液包含DMEM、10%小牛血清、0.03% L?2谷氨酰胺、100 U /ml 青霉素、125 mg/L 鏈霉素。培養(yǎng)箱設(shè)置為37 ℃、5% CO2環(huán)境。
1.3 藥物處理及細(xì)胞分組 VE溶于99.5%乙醇，DXR溶于培養(yǎng)液。10 μmol/L DXR分別與0.1 mmol/L，1 mmol/L VE合用處理細(xì)胞2 h，8 h和12 h。細(xì)胞分為空白組(未經(jīng)藥物處理)，溶劑對(duì)照組(99.5%乙醇處理)，陽性對(duì)照組(10 μmol/L DXR處理)，10 μmol/L DXR+0.1 mmol/L VE組，10 μmol/L DXR+1 mmol/L VE組。
1. 4 堿性彗星實(shí)驗(yàn) 藥物處理細(xì)胞后，離心收集，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至6×1010/L 。制備“三明治”凝膠：首先用100 μl 0.65%正常熔點(diǎn)瓊脂糖，平鋪在毛面載玻片上，并蓋上蓋玻片，置于冰上8 min，使瓊脂糖凝固;移去蓋玻片，再在第一層凝膠上鋪單細(xì)胞懸液(15 μl 6×1010/L 細(xì)胞與75 μl 0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖混合) ;最后在第二層凝膠上鋪75 μl 0.65%低熔點(diǎn)瓊脂糖， 第二、三制膠方法同第一層。最后，移去蓋玻片，凝膠浸泡在4 ℃堿性裂解液(2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris base，1% sodium lauryl sarcosinate，1% Triton X?100 和10% DMSO 用前加入，pH=10 ) 中2 h。裂解完畢轉(zhuǎn)移至盛有高pH電泳緩沖液( 300 mmol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA ) 中以25 V，300 mA 電泳20 min。DAPI 染色，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用comet score 軟件分析尾相( TM )。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 x±s表示, 采用SPSS 12.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和Dunnett 檢驗(yàn), 顯著性界值采用P< 0.05。
2 結(jié)果
10 μmol/L DXR處理CRL?1 927細(xì)胞2、8、12 h，彗尾長(zhǎng)度與對(duì)照組相比明顯增長(zhǎng)。特別是處理細(xì)胞12 h后，彗尾長(zhǎng)度由(4.61±0.67)μm增為(17.56±1.98)μm(見表1)。DXR與0.1 mmol/L VE共同處理細(xì)胞12 h后，彗尾的長(zhǎng)度與DXR組相比明顯變短，但明顯長(zhǎng)于對(duì)照組;處理2、8 h時(shí)兩組彗尾長(zhǎng)度無明顯差異。DXR與1 mmol/L VE共同處理細(xì)胞2 h后，彗尾長(zhǎng)度與DXR處理組無明顯差異;處理細(xì)胞8、12 h后，DXR與1 mmol/LVE共同處理組彗尾的長(zhǎng)度與DXR組相比明顯變短，但仍長(zhǎng)于對(duì)照組，12 h時(shí)彗尾的長(zhǎng)度變化尤為明顯(見圖1)。
表1 堿性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果(略)
注：* 與對(duì)照組比較P<0.05或P<0.01;﹟與DXR組比較P<0.05或P<0.01
對(duì)照組 DXR組 DXR+1 mmol/LVE組
圖1 堿性彗星實(shí)驗(yàn)熒光圖片(12 h)(略)
3 討論
化療藥物DXR殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也殺傷了正常細(xì)胞，常可在治療腫瘤的過程中造成組織損傷，因此其副作用限制了它在臨床中的使用。因此如何提高用藥安全性或者降低藥物細(xì)胞毒性已經(jīng)成為了醫(yī)學(xué)界能否更好使用DXR的一大挑戰(zhàn)。DXR與抗氧化劑的合用為減輕DXR毒性的有效方法之一。但迄今為止，對(duì)DXR心毒性的防治研究較多，對(duì)其腎毒性的防治研究少且不明確。堿性彗星實(shí)驗(yàn)(alkali comet assay)，又稱單細(xì)胞凝膠電泳SCGE(single cell gel electrophoresis)，能夠檢測(cè)單SSB(single strand breaks)、雙鏈的斷裂和堿性不穩(wěn)定點(diǎn)ALS(alkali labile sites)[4]，是目前在單細(xì)胞水平上檢測(cè)DNA 微損傷的最有效方法之一。本研究主要是觀察DXR對(duì)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及抗氧化藥物VE與DXR合用時(shí)是否可保護(hù)細(xì)胞免受其損傷。
本研究首次發(fā)現(xiàn)了DXR可導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞DNA的損傷。10 μmol/L處理CRL?1927細(xì)胞后，彗尾長(zhǎng)度與對(duì)照組相比明顯增長(zhǎng)。DXR處理細(xì)胞2 h后，彗尾長(zhǎng)度為(10.79±1.65)μm，8 h為(14.31±2.10 )μm ，12 h為(17.56±1.98) μm。因此證明了DXR對(duì)細(xì)胞的損傷具有一定的時(shí)間效應(yīng)，可隨時(shí)間的延長(zhǎng)其毒性明顯增加。其原因可能是DXR，蒽環(huán)類細(xì)胞周期非特異性藥物，促進(jìn)了自由基的產(chǎn)生，自由基又使DNA 的堿基和脫氧核糖發(fā)生化學(xué)變化, 引起堿基改變、破壞或脫落，以及DNA單鏈斷裂(single strand breaks，SSBs )和雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)，DNA 與附近蛋白質(zhì)可能形成DNA?蛋白質(zhì)交聯(lián)等。
早期研究報(bào)道VE既可優(yōu)化DXR對(duì)腫瘤的治療又不干擾其療效[5～7]，同時(shí)其他研究人員也發(fā)現(xiàn)VE可加強(qiáng)DXR的毒性[6]或者對(duì)DXR的療效無任何作用[8，9]。
本研究還發(fā)現(xiàn)用DXR和VE共同處理細(xì)胞后，其毒性作用可被消弱。DXR+0.1 mmol VE組在處理細(xì)胞12 h后彗尾長(zhǎng)度可減小到(11.01±1.52) μm，但是在2 h及8 h與DXR組相比無明顯變化。但是較高濃度1 mmol VE和DXR共同處理細(xì)胞時(shí)在三個(gè)時(shí)間段，彗尾長(zhǎng)度與DXR相比都明顯變短。這說明了VE抑制DXR的作用有一定的時(shí)間劑量效應(yīng)，其原因可能是VE是較強(qiáng)的抗氧化劑，具有清除自由基的作用。
綜上所述，DXR造成了腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的DNA的損傷，而VE能抑制DXR對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用，因此可對(duì)抗DXR的腎毒性。
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