平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究

平貝母內(nèi)生真菌的分離及其生物堿產(chǎn)生能力的初步研究 ［摘要］ 目的 從平貝母植株中分離內(nèi)生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規(guī)微生物學方法分離出其中的內(nèi)生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對這些真菌的提取物進行生物堿定性檢測；再對陽性樣品進行TLC分析，并與藥材提取物進行比較。結(jié)果 從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應(yīng)中都呈陽性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現(xiàn)兩個與藥材樣品有相同Rf值的斑點。結(jié)論 該內(nèi)生真菌菌株應(yīng)具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

　�。坳P(guān)鍵詞］ 平貝母；內(nèi)生真菌；生物堿

平貝母（Fritillaria ussuriensis）為常用中藥材，其中的貝母堿類化合物有清熱潤肺、止咳化痰等功效。由于對其需求量大，而且植株生長緩慢，野生資源人為破壞嚴重，自1987年起便被《中國珍稀瀕危保護植物名錄》列為漸危種［1］。植物內(nèi)生真菌是指生活在植物體內(nèi)或生活史的一定階段處于植物體內(nèi)的真菌，它們在植物體內(nèi)的存在具有一定的普遍性，其中一部分可能產(chǎn)生一些與其宿主相同或相似的生理活性成分，包括治療人類疾病的藥物［2，3］。因此，如果能從貝母中分離出可以產(chǎn)生貝母堿類生物堿的內(nèi)生真菌，就有可能采用工業(yè)發(fā)酵的方法生產(chǎn)其藥用成分，這樣不僅可以改善目前該藥材緊缺的狀況，還有利于保護這種珍貴的藥用植物資源。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　平貝母引種自吉林市左家中國特產(chǎn)所，栽種于西北大學校園生物實驗地，春季取整株幼苗作為分離內(nèi)生真菌的實驗材料。平貝母藥材（干燥鱗莖）購自中藥店。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 內(nèi)生真菌的分離

　　用自來水洗凈幼苗上的泥土，在75%酒精中迅速漂洗一下，無菌水沖洗后移入5%的次氯酸鈉溶液中浸泡8 min，最后用無菌水洗3~5遍。將幼苗切成小段，接種到馬丁培養(yǎng)基平板上，置25 ℃條件下培養(yǎng)，切斷邊緣長出菌絲后，按常規(guī)方法進行分離、純化后轉(zhuǎn)接到PDA斜面上備用。

　　1.2.2 培養(yǎng)

　　將在PDA平板上培養(yǎng)的旺盛生長的各菌株菌絲體制成懸液，分別等量接種于裝有50 ml馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每種接5瓶。置往復(fù)式搖床上25 ℃條件下培養(yǎng)，震蕩速度約100次/min。培養(yǎng)5~7天后，將各待測培養(yǎng)物中的菌絲體和培養(yǎng)液過濾分開，菌絲體在60 ℃下烘干備用，濾出的培養(yǎng)液直接用于生物堿的定性檢測。

　　1.2.3 樣品檢測

　　將上述各種菌絲體研碎，分別用80％酒精熱提2次，蒸去酒精，濃縮液滴加5%鹽酸使成酸性，過濾［4］，即為用于生物堿定性檢測的提取液。

取各樣品的菌絲體提取液和培養(yǎng)液少量，分別滴加1~2滴以下3種試劑：（1）碘化鉍鉀試劑（Dragendorff’s reagent），若產(chǎn)生黃至桔紅色沉淀則為陽性反應(yīng)；（2）碘-碘化鉀試劑，若產(chǎn)生棕色或褐色沉淀為正反應(yīng)；（3）碘化汞鉀試劑（Mayer’s reagent），生成類白色沉淀者為正反應(yīng)［5］。

選取上述檢測呈陽性的真菌進一步進行薄層層析（TLC）分析。將干燥的平貝母藥材粉碎，過60目篩作為對照品，與待測菌絲體都于60 ℃烘箱中烘至恒重，按文獻6方法制備樣品［6］。將對照品和樣品提取液都點樣于硅膠G薄板，采用環(huán)己烷-醋酸乙酯-二乙胺（6∶4∶1）作為展開劑，改良碘化鉍鉀試劑為顯色劑，進行TLC檢測。

　　2 實驗結(jié)果與討論

從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，分別以Fu1~Fu9表示之。培養(yǎng)液的3種定性反應(yīng)除少數(shù)為不確定結(jié)果外，均為陰性反應(yīng)，說明其中不含生物堿或生物堿濃度很低。菌絲體提取液的定性反應(yīng)結(jié)果如表1所示。表1 各種內(nèi)生真菌菌絲體提取液的定性反應(yīng)結(jié)果（略）

從表1中可以看出：Fu7菌株的菌絲體提取液在上述3種定性反應(yīng)中都呈明確陽性，說明它具有產(chǎn)生生物堿的能力，因此將其進行進一步的TLC檢測，結(jié)果藥材對照樣品有3個斑點出現(xiàn)，說明其中至少含有3種生物堿；而所測Fu7樣品出現(xiàn)2個斑點，且它們的Rf值與藥材提取物中的兩個點基本相同。因此，樣品中應(yīng)該含有與平貝母中相同或相似的生物堿，對該菌我們還將進行進一步的研究。

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　　1 國家環(huán)境保護局，中國科學院植物研究所.中國珍稀瀕危植物名錄.北京：科學出版社，1987，197-200.

　　2 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進展.菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

　　3 劉蕓，殷紅，彭輝，等.植物內(nèi)生真菌—潛在的天然藥物新來源.中華現(xiàn)代中西醫(yī)雜志，2005，3（5）：404-405.

　　4 上海藥物研究所.中草藥有效成分的提取和分離.上海：上海人民出版社，1972，179-180.

　　5 陳業(yè)高.植物化學成分.北京：化學工業(yè)出版社，2004，275.

　　6 趙得永.4種川貝母的總皂甙、總生物堿及西貝素的含量測定.中國中藥雜志，1994，19（2）：71-73.

　　作者單位： 710069 陜西西安，西北大學生命科學學院

　�。壅�要］ 目的 從平貝母植株中分離內(nèi)生真菌，從中篩選可以產(chǎn)生與貝母藥材相同或相似生物堿的菌株。方法 以平貝母幼嫩植株為材料，用常規(guī)微生物學方法分離出其中的內(nèi)生真菌。以碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀試劑和碘化汞鉀試劑分別對這些真菌的提取物進行生物堿定性檢測；再對陽性樣品進行TLC分析，并與藥材提取物進行比較。結(jié)果 從平貝母幼苗中共分離出9種內(nèi)生真菌，其中一種（Fu7）在3種生物堿定性反應(yīng)中都呈陽性，其菌絲提取物經(jīng)薄層層析后，出現(xiàn)兩個與藥材樣品有相同Rf值的斑點。結(jié)論 該內(nèi)生真菌菌株應(yīng)具有產(chǎn)生貝母生物堿的能力。

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