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管碟法測定抗生素效價中的影響因素分析及對策
關(guān) 鍵 字:管碟法；抗生素；效價；抑菌圈
摘 要: 目的 提高管碟法測定抗生素效價的準確性。 按操作步驟逐步，并提出合理的解決方案。 結(jié)果 減少外界因素與人為因素給試驗帶來的誤差。 結(jié)論 可以提高測定結(jié)果的準確性。
Abstract: OBJECTIVE To improve the veracity of antibiotics titer evaluation by cylinder-plate method. METHOD According to the process of test, analyze the test and offer a proper measure to avoid influencing factors. RESULTS Reduce the errors caused by environmental and artificial factors. CONCLUSION This can improve the veracity of test results. Key words: cylinder-plate method; antibiotics; titer; bacterial inhibition ring 管碟法是國內(nèi)外常用的抗生素微生物檢定法[1]，利用管碟法測定抗生素效價，具有準確、直觀、重復(fù)性好等優(yōu)點，因而被廣泛采用。但是整個試驗過程中結(jié)果的因素很多，任何一個環(huán)節(jié)操作不當或者忽略就會造成很大誤差，導(dǎo)致整組試驗失敗。根據(jù)實際操作中的積累經(jīng)驗，對管碟法中影響試驗結(jié)果的因素進行如下分析及提出解決的方法。 1. 實驗器材的準備 1.1 實驗器材的選擇 試驗應(yīng)該選擇底面平整的玻璃雙碟，避免底面的凹凸影響瓊脂層的厚度�？蓪㈦p碟放置在水平臺上，下墊一層白紙，加入3mL水，再滴加藍墨水，根據(jù)藍色是否深淺一致來判斷雙碟底面平整程度。小鋼管則應(yīng)該選擇加工精細的同一批產(chǎn)品，這樣才能保證管壁厚薄與重量均勻一致，使得小鋼管在培養(yǎng)基中下陷相同的深度，抗生素溶液擴散均勻有可比性。如果小鋼管兩端不夠平，就應(yīng)予剔除，否則會使抗生素溶液漏出，破壞均勻擴散現(xiàn)象。 1.2 實驗器材的清洗 抗生素試驗中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。因此，在清洗時要尤為注意多用流水沖洗。160℃干熱滅菌2h后備用。 2. 配制試驗所需的樣品、標準品、緩沖液與培養(yǎng)基 2.1 樣品與標準品溶液的配制 標準品與樣品從冰箱取出后，使與室溫平衡。供試品應(yīng)放于干燥器內(nèi)至少30min方可稱取。稱量最好為一次取樣稱量，動作迅速，不得反復(fù)稱取，取樣后立即將稱量瓶瓶蓋蓋好，以免吸水。標準品的稱量最好用1/100,000克的分析天平，樣品稱量不得低于1/10,000克的分析天平。天平中的干燥劑應(yīng)保持經(jīng)常注意更換。稱量結(jié)束后，加入超聲波處理后的磷酸緩沖液，定容至刻度，過濾并稀釋。稀釋時，都應(yīng)采用容量瓶，每一步稀釋取樣量不得少于2mL。用刻度吸管吸取溶液前，要用待稀釋液沖洗吸管2～3次，吸取溶液后，要用濾紙把刻度吸管外壁多余液體擦去，再從起始刻度開始放溶液。把稀釋后的抗生素溶液分裝至干燥滅菌試管待用。在稱量抗生素樣品過程中，操作者的工作服上有可能會沾染抗生素粉末，在配培養(yǎng)基、加底層培養(yǎng)基、加菌層培養(yǎng)基或滴加抗生素溶液時，會隨衣袖的抖動落入培養(yǎng)基，造成破圈或者無抑菌圈。所以配制抗生素溶液應(yīng)單獨使用一套工作服。 2.2 培養(yǎng)基與緩沖液的配制 配制培養(yǎng)基與緩沖液時要按照的配比用量，配制后調(diào)節(jié)其pH值。因為在pH值、鹽濃度的影響下，即使瓊脂培養(yǎng)基上的兩個相鄰的小管距離足夠，還是可能會出現(xiàn)卵圓形抑菌圈。例如四環(huán)素易受pH值影響，鏈霉素易受鹽濃度影響[2]。培養(yǎng)基可以購買廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品，因為大批量產(chǎn)品中的成分配比較穩(wěn)定，可比性較強。116℃濕熱滅菌20min后備用。 3. 加注培養(yǎng)基 3.1 加注底層培養(yǎng)基
無菌室工作臺面可能因為使用時間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會給試驗造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。在雙碟底部預(yù)先標記樣品的高低濃度區(qū)域，在加注培養(yǎng)基底層的時候，有順序地按照一致方向排列。接下來加注培養(yǎng)基菌層的時候，仍然按照原來的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養(yǎng)基菌層是在水平的培養(yǎng)基底層上鋪開，達到消除誤差的目的。 試驗中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗帶來誤差。加注60～80℃的培養(yǎng)基底層之后，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因為溫度過高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。 3.2 加注培養(yǎng)基菌層 制備瓊脂培養(yǎng)基菌層時，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時間太長都會導(dǎo)致試驗菌死亡。當菌種為非芽孢桿菌的時候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至?xí)霈F(xiàn)無菌生長。因此，培養(yǎng)基應(yīng)放在50℃水浴中保溫。當加入試驗菌種混勻后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗的時候，如果從大瓶內(nèi)用刻度吸管吸取帶菌培養(yǎng)基，吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養(yǎng)基分裝在具塞試管內(nèi)，每管5mL，濕熱滅菌后放在50℃水浴鍋內(nèi)保溫。試驗中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續(xù)保溫5min使培養(yǎng)基溫度回升，然后直接倒在底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動雙碟使培養(yǎng)基均勻鋪開。 4. 放置小鋼管 放置小鋼管時，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。可在試驗前在雙碟的底上用尺測量，作好標記，試驗中可以按照雙碟底面標記放置小鋼管，避免放置位置不恰當產(chǎn)生的。小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。 5. 滴加抗生素溶液 滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二劑量法）或者SH→TH→SM→TM→SL→TL（三劑量法）的順序滴加[3]。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生素到小鋼管的時候，由于毛細管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細管開口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進行滴加，毛細管口應(yīng)避免太細，滴加的時候離開小鋼管口距離不要太高。滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入小鋼管后，沒有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這樣是不會產(chǎn)生抑菌圈的。此時可以小心的用滴管吸出小鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加。抗生素溶液滴加后，液面應(yīng)該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。 6. 雙碟中菌株的培養(yǎng) 滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運到培養(yǎng)箱的過程中，可以預(yù)先在培養(yǎng)箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養(yǎng)箱，緩慢推入箱內(nèi)。雙碟在37℃下培養(yǎng)約16h。時間太短會造成抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生素的敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續(xù)生長，使得抑菌圈變小。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻（過于接近熱源），會造成同一雙碟上細菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養(yǎng)中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應(yīng)經(jīng)常注意溫度，防止意外過冷過熱。
7. 抑菌圈測量 7.1 試驗結(jié)果中抑菌圈直徑不應(yīng)該過大或者過小，在試驗之前，可以先做一個關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預(yù)試驗，選擇抑菌圈直徑在18～22mm的菌液濃度為試驗用濃度（菌液濃度約為106個/mL）。批量試驗中后期，菌液保存的時間過久，菌株就會逐漸衰亡，生長周期不一致，其對抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈。如若菌株不純，也會造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。 7.2 用游標卡尺測量抑菌圈直徑，可以在雙碟底部墊一張黑紙，在燈光下測量。不宜取去小鋼管再測量，因為小鋼管中殘余的抗生素溶液會流出擴散，使抑菌圈變得模糊。不能把雙碟翻轉(zhuǎn)過來測量抑菌圈直徑，因為底面玻璃折射會影響抑菌圈測量的準確度。記錄測量結(jié)果后進行效價。 8.討論 試驗中，往往會出現(xiàn)異常情況，使得試驗結(jié)果與預(yù)期出現(xiàn)很大差異。因此抗生素試驗的每一步都需要仔細謹慎，嚴格按照操作規(guī)范，才可以得到準確的檢測結(jié)果。準確測定抗生素效價，對評價抗生素的效果，指導(dǎo)臨床都有著重要意義。
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