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CLA對HepG2細胞脂肪堆積的影響
【摘要】目的 研究共軛亞油酸對HepG2細胞中脂質(zhì)沉積的影響。方法 以HepG2細胞為研究對象，以不同濃度CLA（10μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1）作用細胞24小時，采用油紅染色、RT-PCR等方法檢測肝臟脂肪沉積、ACC mRNA表達，觀察CLA對肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響。結果 CLA增加HepG2細胞中脂質(zhì)沉積，50μmol·L-1CLA組細胞中紅染脂滴與對照組相比明顯增多；CLA使HepG2細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸降低，50μmol·L-1組的培養(yǎng)液中游離脂肪酸與對照組相比含量降低了50%（P< 0.05）；CLA增加HepG2細胞ACC mRNA的表達，ACC mRNA表達水平隨CLA濃度增加而增高。結論 CLA可增加HepG2細胞的脂肪沉積；其機制可能與CLA能夠改變肝細胞中ACC的表達有關。【關鍵詞】共軛亞油酸 (CLA) HepG2細胞 脂肪代謝 ACC
共軛亞油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是由一組具有共軛不飽和雙鍵的亞油酸的異構體構成的混合物。1987年Michael Pariza研究小組分離出CLA，能夠抑制化學誘導的皮膚腫瘤形成[1]。CLA有減輕肥胖、抗腫瘤、防止動脈粥樣硬化、提高機體免疫力、增加骨密度、促進生長等多種生理功能。但是一些研究發(fā)現(xiàn)，CLA在減少體內(nèi)脂肪的同時，可能出現(xiàn)肝臟脂肪代謝障礙，出現(xiàn)肝臟脂肪沉積的現(xiàn)象，其確切的分子機制尚不明確[2]。本實驗就是研究CLA對肝臟細胞脂肪堆積的影響。
1 材料
1.1 HepG2細胞
第四軍醫(yī)大學營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室惠贈。
1.2 主要試劑
高糖DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司；新生小牛血清，杭州四季青；胰蛋白酶，Wolsen公司，四甲基偶氮噻唑蘭(MTT)，Amresco公司；油紅O-0625，Sigma公司，共軛亞油酸（CLA），Sigma公司；游離脂肪酸測試盒南京建成科技有限公司；TRIZOL，Invitrogen公司；反轉錄試劑盒Fermentas公司葡萄糖試劑盒，上海復星公司。
1.3 主要儀器與設備
NU-2500E型CO2孵箱，倒置相差顯微鏡，YI-875SA醫(yī)用超凈工作臺，酶聯(lián)免疫檢測儀，MyCycler thermal cycle，凝膠成像儀等。
1.4 引物
引物由奧達公司合成，其中ACC引物為：5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’；5’- TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。
β-ACTIN引物為：5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。
2 實驗方法
2.1 細胞培養(yǎng)
HepG2細胞置于含10％新生小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，含有100 IU/ml 青霉素，100μg/ml鏈霉素，37℃、5％CO2、飽和濕度的恒溫孵箱條件下培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化液消化。
2.2 油紅O染色觀察HepG2細胞脂質(zhì)沉積
將HepG2細胞接種于放有干凈蓋玻片的6孔板內(nèi)，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞長至80%滿時，吸棄培養(yǎng)液，加入不同濃度CLA作用24小時后，終止培養(yǎng)；棄培養(yǎng)液，每孔加入1ml10%的甲醛溶液室溫孵育5分鐘。除去甲醛溶液，加入同等體積的10%甲醛室溫孵育1小時，用錫紙包封好避免干燥；除去甲醛溶液，60%的異丙醇沖洗，完全干燥；加入油紅O工作液放置10分鐘，除去油紅O立即用蒸餾水沖洗4次，晾干后在倒置顯微鏡下觀察。
2.3 染色法測定培養(yǎng)液中的游離脂肪酸
將HepG2細胞以每孔5×104個細胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細胞長至80%滿時，吸棄培養(yǎng)液，將實驗組分為1%血清的DMEM培養(yǎng)液空白對照組（無細胞），正常細胞對照組（含1%血清的DMEM培養(yǎng)液）、CLA干預組(濃度為0、10、50、100μmol·L-1)，每組設3孔并列，孵箱中培養(yǎng)24小時后吸棄培養(yǎng)液，CLA干預組每孔加入1ml 100nmol·L-1的胰島素溶液作用1小時后，按照試劑盒說明書方法，采用比色法測定培養(yǎng)液中游離脂肪酸的變化，同時24孔板內(nèi)細胞胰酶消化后細胞計數(shù)板計數(shù)。
2.4 胞總RNA的提取
用TRIZOL試劑按操作說明書提取，提取的RNA用約25μL DEPC 處理水溶解。
2.5 RNA純度鑒定
取RNA5μL，稀釋100倍后用紫外分光光度計測定其OD260和OD280值，并計算OD260/OD280值及RNA濃度。
2.6 cDNA的合成
（1）以提取的總RNA3μg為模板，cDNA合成反應體系為12μL，包括：提取的總RNA模板3μg，Primer Oligo（dT）5μL，RNase，用DEPC水補至12μL。3-5sec離心混勻，65℃加熱5min后置于冰浴中。
（2）逆轉錄反應 反應體系包括：5×RTbuffer 4μL；RNase Inhibitor 1μL；10mMdNTPmix 2μL；Rever Tra Ace 1μL；補水到20μL。3-5sec離心混勻，37℃孵育5min后冰浴。
（3）加入M-MuLV反轉錄酶1μL，總體積為20μL。離心混勻，3-5s，42℃孵育60min。
（4）70℃加熱10min以終止反應。合成的cDNA保存于-20℃或用于擴增。
2.7 PCR反應體系
10×Reaction Buffer 5μL；10mM dNTPs 1μL；Primer1(P1)和 Primer2(P2) 各20pmol；cDNA 2μL；KOD-Plus 1μL； H2O 33μL，總體積為50μL。
PCR擴增條件為: 解鏈95℃，60s；聚合55℃，60s；延伸72℃，45s，共30個循環(huán)。
2.8 瓊脂糖凝膠電泳及圖像處理
取各組肝細胞RT-PCR產(chǎn)物10μL及DNAMarker（TAKARA），在1%瓊脂糖中進行凝膠電泳，電泳結果用GeneFlash成像系統(tǒng)（SynGene，USA）采集染色條帶后轉入計算機，并用GeneSnap圖像分析軟件分析各條帶。結果以圖像掃描的像素值表示。
2.9 統(tǒng)計學處理
實驗數(shù)據(jù)用x-±s表示，組間差異比較用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，以P＜0.05為顯著性差異水準。
3 實驗結果
實驗結果一
3.1 CLA對HepG2細胞脂質(zhì)沉積的影響
如圖1所示，與對照組相比較，CLA作用24小時后50μmol·L-1和100μmol·L-1 CLA組細胞中紅染脂滴明顯增多。提示肝細胞脂質(zhì)沉積可能隨著CLA作用濃度提高而增加。
圖1 CLA作用后HepG2肝細胞中脂質(zhì)沉積。油紅O染色，倒置顯微鏡觀察。(×200)
(a：正常細胞；b：正常細胞+胰島素；c：10μmol·L-1 CLA；d：50μmol·L-1CLA；e：100μmol·L-1 CLA）
3.2 CLA對HepG2細胞培養(yǎng)液中游離脂肪酸含量的影響
由表1可見，不同濃度CLA干預HepG2細胞24小時，胰島素溶液干預1小時后，與0μmol·L-1 CLA相比，50μmol·L-1、100μmol·L-1 CLA組的培養(yǎng)液中游離脂肪酸的含量分別降低了25%、50%，有顯著性差異（P<0.05），提示CLA干預可能促進了細胞對培養(yǎng)液中游離脂肪酸的吸收。DMEM培養(yǎng)液對照組為無細胞空白對照組。
表1 CLA對HepG2細胞對培養(yǎng)液中游離脂肪酸的影響 (x-±s)
實驗結果二
3.1 CLA作用增加ACC mRNA表達
從圖2可以看出，與對照組相比，ACC mRNA表達水平隨CLA濃度增加而逐漸增高。相對于胰島素單獨作用組，50 μmol·L-1 CLA+胰島素組和100 μmol·L-1 CLA，ACC的mRNA表達水平增高明顯，分別增加了1.38倍、1.43倍（n = 5，P<0.05），而10μmol·L-1 CLA。同時胰島素單獨作用組與對照組相比增加了2.26倍（n=5，P<0.05）。提示胰島素單獨作用可以增加ACC mRNA的表達，而CLA作用可以促進ACC mRNA的表達進一步升高，并具有濃度依賴效應。
圖2：RT-PCR方法檢測CLA作用后肝細胞中ACC mRAN的表達
(1:正常細胞;2:正常細胞+胰島素;3:10μmol·L-1 CLA：50μmol.L-1 CLA；5：100μmol.L-1 CLA）
注：*與對照組比較 P<0.05；#與胰島素組比較 P<0.05
4 討論
CLA的作用可以減少機體肌肉組織脂肪蓄積，其通過增加機體線粒體中脂肪酸β-氧化過程而影響機體內(nèi)脂質(zhì)的沉積，脂肪酸β-氧化中的關鍵酶肉毒堿棕櫚�；D移酶1（carnitine palmitoyl-CoA transferase 1，CPT1）在CLA作用下明顯增加，導致肌肉組織中脂肪氧化分解代謝增強，脂肪蓄積減少。有結果顯示，CLA作用肝臟導致脂肪堆積，可能是由于脂肪合成增多而分解代謝減少引起的，乙酰輔酶A羧化酶(ACC)是肝臟脂肪合成中的關鍵酶，是長鏈脂肪酸的生物合成中限速酶，主要調(diào)節(jié)脂肪酸的合成，ACC催化乙酰輔酶A形成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸合成和代謝中起重要作用的中間代謝物[3]，調(diào)控骨骼肌心臟和肝臟中脂肪酸的氧化[4]。因此推測CLA致使肝臟中脂肪沉積可能是增加ACC增多，脂肪合成增多，同時增加丙二酰CoA，從而抑制了線粒體CPT1的活性及脂肪酸β-氧化過程，脂肪分解減少導致脂肪在肝細胞蓄積。
乙酰輔酶A羧化酶(ACC)在脂肪酸的代謝過程中起著重要作用。ACC包括乙酰輔酶A 羧化酶1- ACC1（ACCα）和乙酰輔酶A 羧化酶2- ACC2（ACCβ）兩種形式，被不同的基因編碼。ACCβ主要在β-氧化作為主要能量來源的骨骼肌和心臟中表達[5]。ACC活性受到別構效應物和磷酸化的調(diào)節(jié)[6]。
實驗中通過檢測細胞內(nèi)ACCmRNA的表達，發(fā)現(xiàn)隨著CLA的劑量增高，ACCmRNA表達逐步增高，ACC表達增高，進一步導致丙二酰CoA增加，細胞內(nèi)CPT1的活性受到抑制，細胞脂肪合成增加而分解減少，CLA干預后的培養(yǎng)液中游離脂肪酸減少，提示更多的脂肪酸滿足細胞脂肪合成的需要，同時脂肪分解減少，引起肝臟脂肪沉積。但其機制還不甚明確，需要進一步實驗證實。
參 考 文 獻
[1]Pariza MW，Ashoor SH，Chu FS，Lund DB: Effects of temperature and time on mutagen formation in pan-fried hamburger. Cancer Lett 1979，7:63-69.
[2]Takahashi Y，Kushiro M，Shinohara K， Ide T: Activity and mRNA levels of enzymes involved in hepatic fatty acid synthesis and oxidation in mice fed conjugated linoleic acid. Biochim Biophys Acta 2003， 1631:265-273.
[3]Ha YL，Grimm NK，Pariza MW: Anticarcinogens from fried ground beef: heat-altered derivatives of linoleic acid. Carcinogenesis 1987，8:1881-1887.
[4]Degrace P，Demizieux L，Gresti J，Chardigny JM，Sebedio JL，Clouet P: Hepatic steatosis is not due to impaired fatty acid oxidation capacities in C57BL/6J mice fed the conjugated trans-10，cis-12-isomer of linoleic acid. J Nutr 2004，134:861-867.
[5]McGarry JD，F(xiàn)oster DW: Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980，49:395-420.
[6]Tong L: Acetyl-coenzyme A carboxylase: crucial metabolic enzyme and attractive target for drug discovery. Cell Mol Life Sci 2005，62:1784-1803.
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