談補(bǔ)陽還五湯對腦缺血大鼠神經(jīng)功能及細(xì)胞形態(tài)的影響論文
腦缺血屬中風(fēng)范疇，是臨床常見病，具有高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率的特點，嚴(yán)重危害著人類健康。迄今為止，國內(nèi)外在治療腦缺血及其后遺癥方面還缺少有效的化學(xué)治療藥物。循證醫(yī)學(xué)表明，中醫(yī)藥對缺血性腦卒中的治療有一定優(yōu)勢。當(dāng)前大量研究集中在中藥對急性腦缺血損傷的保護(hù)作用。而腦缺血后的功能恢復(fù)是一個較長時間過程，目前對其進(jìn)行較長時間觀察的研究較少。出自清代王清任《醫(yī)林改錯》的補(bǔ)陽還五湯，是治療缺血性中風(fēng)及中風(fēng)后遺癥的經(jīng)典名方，該方在臨床上應(yīng)用廣泛且療效確切，但其促神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。本文采用大腦中動脈線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型，探討了補(bǔ)陽還五湯較長時間多時間點對其神經(jīng)功能的保護(hù)作用，以期為治療缺血性腦中風(fēng)臨床用藥提供實驗依據(jù)。
1 材料
1. 1 動物健康雄性SD 大鼠189 只，SPF 級，體重260 ～ 280 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK( 湘) 2009-0004，動物合格證號004535。
1. 2 藥物補(bǔ)陽還五湯處方來源于清·王清任《醫(yī)林改錯》，按原方組成: 黃芪120 g，赤芍4. 5 g，川芎3 g，歸尾6 g，干地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥研究院鑒定均符合《中國藥典》2005 年版標(biāo)準(zhǔn)。補(bǔ)陽還五湯藥劑制備: 飲片先用清水浸泡30 min，第一煎加藥材及5 倍體積雙蒸水，煎煮60min，二煎5 倍體積雙蒸水，煎煮60 min，兩煎混勻，濃縮至含生藥2 g·mL - 1，冷藏待用。
1. 3 試劑10% 水合氯醛( 揚(yáng)州市奧鑫助劑廠) ，多聚甲醛( 長沙市錦華化工有限公司) ，TTC( 紅四氮唑，Sigma 公司) 。
1. 4 儀器Bx51 光學(xué)顯微鏡及IPP5. 1 圖像分析系統(tǒng)( 日本Olympus) ，F(xiàn)A 型電子天平( 上海臺之衡電子衡器有限公司) ，自動雙重純水蒸餾器( 上海玻璃儀器一廠) ，F(xiàn)inesse 325 型石蠟切片機(jī)( 英國Shando) 。
2 方法
2. 1 分組與給藥將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)陽還五湯組，每組63 只，每組動物又分3 個時間點，即分別于首次給藥后7， 14， 21 d 處死，每個時間點21 只動物。補(bǔ)陽還五湯組動物于術(shù)后2 h后開始給藥，給藥劑量為5 g·kg - 1·d - 1，每日ig 1次。模型組和假手術(shù)組動物均給予等體積蒸餾水。
2. 2 模型制備與評價參照文獻(xiàn)采用大腦中動脈線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血模型: 10% 水合氯醛( 3. 5 mL·kg - 1 ) ip 麻醉，取頸正中切口長約3cm，逐層分離，結(jié)扎頸外動脈，夾閉頸內(nèi)動脈、再結(jié)扎頸總動脈，于頸總動脈充盈分叉部下方約4 mm處將一長為4 cm 直徑為0. 26 mm 的尼龍魚線插入頸內(nèi)動脈，直到遇到輕微阻力為止，固定尼龍線，縫合切口。假手術(shù)組僅切開皮膚、分離左側(cè)頸總動脈后隨即縫合。術(shù)后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒內(nèi)，自由飲水、進(jìn)食。動物清醒2 h 后參照Longa及Bederson的5 分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評分，分值在1 ～ 3 分者入組。0 分: 無神經(jīng)損傷癥狀; 1 分: 不能完全伸展對側(cè)前爪; 2 分: 向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈; 3 分: 向?qū)?cè)傾倒; 4 分: 不能自發(fā)行走，意識喪失。評分越高，神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，反之亦然。不納入標(biāo)準(zhǔn): 評分低于1 分; 蛛網(wǎng)膜下腔出血; HE 染色無腦缺血病理改變; 未到時間點死亡。死亡等不足動物時隨機(jī)替補(bǔ)。
2. 3 指標(biāo)檢測
2. 3. 1 TTC 染色測腦梗死面積比每組每個時間點5 只大鼠， 10% 水合氯醛麻醉后，斷頭取大腦，置于- 20 ℃ 冷凍20 min 后，自額極每隔2 mm 切1片。第1 刀在腦前極與視交叉連線中點處; 第2 刀在視交叉部位; 第3 刀在漏斗柄部位; 第4 刀在漏斗柄與后葉尾極之間，共A，B，C，D，E 5 片。用2%的紅四氮唑染色，37 ℃下避光30 min，正常組織呈深紅色，而梗死組織則為白色。拍照后選最大缺血斷面C 片梗死面積，運(yùn)用Image-Pro Express 圖像分析系統(tǒng)掃描計算，取梗死面積占C 片大腦總面積的百分比表示。為消除梗死側(cè)大腦半球因腦水腫造成的誤差，按Swanson 方法進(jìn)行校正后計算C 片梗死面積百分比( IS) 。IS = ( S1 - Sr) /2S1 × 100%S1: C 片健側(cè)總面積; Sr: C 片患側(cè)非梗死區(qū)面積。
2. 3. 2 神經(jīng)功能評分每組每個時間點10 只大鼠，于術(shù)后2 h 及動物處死前1 h 進(jìn)行神經(jīng)功能評分。
2. 3. 3 HE 染色觀察海馬、皮質(zhì)組織病理學(xué)變化每組每個時間點6 只。同2. 3. 1 取大腦后4% 多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，腦冠狀連續(xù)切片( 片厚5 μm) ，取含海馬切片貼于載玻片上，隨后HE 染色，光鏡下觀察比較各組大鼠左側(cè)海馬、皮質(zhì)組織細(xì)胞形態(tài)病理學(xué)改變。
2. 4 統(tǒng)計學(xué)分析
所有數(shù)據(jù)以珋x ± s 表示，應(yīng)用SPSS 19. 0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較用單因素方差分析，P < 0. 05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3 結(jié)果
3. 1 各組腦梗死面積比較通過TTC 染色，假手術(shù)組著色比較均勻，為深紅色; 7， 14， 21 d 模型組與補(bǔ)陽還五湯組染色不均勻，局部梗死區(qū)為白色，梗死部位在缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)、海馬周圍。梗死面積分析顯示，模型組和補(bǔ)陽還五湯組隨時間點后延腦梗死面積均逐漸縮小( P < 0. 05) ; 且7， 14， 21 d 補(bǔ)陽還五湯組梗死面積明顯小于同時相模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( P < 0. 05) 。
3. 2 各組神經(jīng)功能評分情況假手術(shù)組各時間點大鼠神經(jīng)功能評分均為0 分; 補(bǔ)陽還五湯組各時間點神經(jīng)功能評分均較同時相模型組低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( P < 0. 05) 。
3. 3 各組海馬、皮質(zhì)組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
3. 3. 1 海馬假手術(shù)組海馬細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞輪廓清晰可見，細(xì)胞核染色均勻，細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)著色均勻。7，14，21 d 模型組海馬神經(jīng)細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，核邊集嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)有空泡，細(xì)胞形態(tài)由橢圓形變成梭形、三角形，細(xì)胞間間距增大，間質(zhì)染色稀疏，有空洞。7， 14， 21 d 補(bǔ)陽還五湯組海馬細(xì)胞空泡樣細(xì)胞較模型組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞排列較模型組整齊。7，14 d 補(bǔ)陽還五湯組仍存在少量核深染及空泡樣改變細(xì)胞，但21 d 補(bǔ)陽還五湯組海馬細(xì)胞形態(tài)接近假手術(shù)組。
3. 3. 2 皮質(zhì)假手術(shù)組皮質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，邊緣清晰，排列整齊，形態(tài)完整，胞核著色均勻，細(xì)胞間質(zhì)染色均勻。7，14，21 d 模型組缺血細(xì)胞呈空泡樣壞死，細(xì)胞形態(tài)喪失，細(xì)胞間間隙增大，染色變淺，呈網(wǎng)狀改變; 殘存細(xì)胞其體積縮小、細(xì)胞核固縮深染、細(xì)胞邊界不清。補(bǔ)陽還五湯組各時間點皮質(zhì)細(xì)胞空泡樣細(xì)胞較同時間相模型組明顯減少，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)細(xì)胞核較清晰，細(xì)胞間隙染色較均勻。
4 討論
局灶性腦缺血又稱缺血性腦卒中，是由于腦的血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧，所致相應(yīng)區(qū)域腦梗死性壞死，大量神經(jīng)元喪失，而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀與體征，是腦血管疾病中最為常見的臨床類型。目前西醫(yī)治療腦缺血的主要方法包括溶栓、抗凝、降纖、擴(kuò)血管、高壓氧、介入治療等，還有尚處于動物實驗階段的基因治療、神經(jīng)干細(xì)胞移植等。這些治療方法中除了超早期( 發(fā)病3 h 內(nèi))溶栓治療有效率高達(dá)21% ～ 93%，其他療法效果并不確定。而且溶栓治療因其嚴(yán)格的時間窗，意味著只有不到5% 的病人有機(jī)會進(jìn)行這一治療。因此，缺血性腦中風(fēng)的病人約80% 留下不同程度的后遺癥——神經(jīng)功能缺損。
典型的缺血性腦卒中在臨床上可按照病程分為3 期。第1 期急性期，腦卒中后1 個月內(nèi); 第2 期恢復(fù)期，腦卒中后2 ～ 6 個月內(nèi); 第3 期后遺癥期，腦卒中6 個月后。補(bǔ)陽還五湯主要用于腦缺血恢復(fù)期及后遺癥期治療，是治療腦缺血后遺癥的首選方，臨床應(yīng)用療效顯著。因此在動物實驗中我們觀察的時間點最長達(dá)到缺血后21 d，這相當(dāng)于人腦缺血后遺癥期。本實驗研究中，神經(jīng)功能評分結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。其作用機(jī)制有學(xué)者認(rèn)為與促血管生成、擴(kuò)血管、抗凝、溶栓等改善腦缺血局部微循環(huán)，減輕腦水腫及氧自由基損傷，保護(hù)腦組織，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。本實驗室及國內(nèi)其他實驗室研究表明補(bǔ)陽還五湯能促進(jìn)缺血后腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移、分化，可能也是其促進(jìn)缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)制之一。通過比較各組動物腦梗死面積比，結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯各時間點分別較同時間相模型組腦梗死面積明顯縮小�？赡艿脑蛴�: 其一，補(bǔ)陽還五湯在腦缺血急性期起腦保護(hù)作用，抑制了大量神經(jīng)元死亡與凋亡導(dǎo)致梗死面積變小; 其二，補(bǔ)陽還五湯促進(jìn)缺血后腦組織再生、修復(fù)、代償，而導(dǎo)致梗死面積較相應(yīng)的模型組縮小; 二者也可能兼而有之。另外，通過比較補(bǔ)陽還五湯組與模型組缺血后海馬、皮質(zhì)組織學(xué)改變，結(jié)果表明補(bǔ)陽還五湯能明顯改善細(xì)胞形態(tài)與排列，促進(jìn)腦缺血損傷后組織修復(fù)。
總之，本研究證實了補(bǔ)陽還五湯具有降低腦缺血神經(jīng)功能評分、減小腦梗死面積、改善腦組織細(xì)胞形態(tài)與排列的腦保護(hù)作用，為該藥臨床治療缺血性腦卒中提供了有力的實驗依據(jù)。
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