細(xì)胞工程論文
細(xì)胞工程是生物工程的一個(gè)重要方面�？偟膩�(lái)說(shuō)，它是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，進(jìn)行在細(xì)胞水平上的遺傳操作及進(jìn)行大規(guī)模的細(xì)胞和組織培養(yǎng)。下面是小編為大家整理的細(xì)胞工程論文，歡迎閱讀。
【摘要】目的制作去細(xì)胞肌肉組織工程支架，并檢測(cè)其與人羊膜上皮細(xì)胞的生物相容性。方法 采用TNT和十二烷基磺酸鈉結(jié)合的化學(xué)萃取方法制作去細(xì)胞肌肉組織工程支架，冰凍切片觀察其結(jié)構(gòu)。將人羊膜上皮細(xì)胞種入支架培養(yǎng)7 d后，用免疫組化檢測(cè)羊膜上皮細(xì)胞的增殖活性、NT3及BDNF的表達(dá),掃描電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 支架中細(xì)胞去除完全，其主要結(jié)構(gòu)為平行排列的管狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分彈性纖維和膠原纖維保持完好。羊膜上皮細(xì)胞在支架里有增殖活性，并呈現(xiàn)NT3、BDNF免疫反應(yīng)陽(yáng)性。掃描電鏡顯示，羊膜上皮細(xì)胞在支架中分布均勻，生長(zhǎng)良好。結(jié)論 成功的制作了去細(xì)胞肌肉組織工程支架，其與人羊膜上皮細(xì)胞有良好的相容性。
【關(guān)鍵詞】去細(xì)胞肌肉;人羊膜上皮細(xì)胞;生物相容性
近年來(lái)組織工程研究的重要進(jìn)展之一就是采用自體或異體移植物制作天然生物降解材料的組織工程支架。其中去細(xì)胞移植物與機(jī)體有良好的生物相容性。去細(xì)胞肌肉支架可作為生物工程支架支持神經(jīng)細(xì)胞軸突再生。Mligiliche等〔1〕把去細(xì)胞肌肉移植入大鼠坐骨神經(jīng)缺損處,4 w后發(fā)現(xiàn)有大量神經(jīng)軸突長(zhǎng)入去細(xì)胞肌肉支架中。由于單獨(dú)應(yīng)用去細(xì)胞肌肉支架治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果有限，去細(xì)胞肌肉支架要發(fā)揮更大的作用往往需要向支架中植入種子細(xì)胞〔2，3〕。研究表明羊膜上皮細(xì)胞可分泌多種神經(jīng)因子〔4，5〕，促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)，是一種良好的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的種子細(xì)胞。本研究利用化學(xué)去細(xì)胞的方法制成去細(xì)胞肌肉支架，并把羊膜上皮細(xì)胞種入去細(xì)胞肌肉支架內(nèi)，探究?jī)烧叩南嗳菪裕瑸殚_展組織工程治療神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病提供新的途徑。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar 大鼠由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.1.2 試劑 IMDM培養(yǎng)基及小牛血清由Hyclone 公司提供。5′溴尿嘧啶核苷(BrdU) 及BrdU 單克隆抗體購(gòu)自Neomarker公司;神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素(NT)3,腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)兔抗人多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司，SABC免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物公司。人羊膜上皮細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 方法
1.2.1 去細(xì)胞肌肉支架的制備 參考 Brown等〔6〕去細(xì)胞膀胱的制作方法制備去細(xì)胞肌肉支架，簡(jiǎn)述如下：取Wistar大鼠腹鋸肌，放入蒸餾水中，在搖床中以37℃、50 r/min搖48 h后,轉(zhuǎn)入3%的TritonX100溶液,搖床中37℃、50 r/min搖48 h。然后放入蒸餾水中，搖床37℃、50 r/min搖48 h。換成1% SDS溶液，搖床37℃，50 r/min搖48 h。PBS洗24 h。PBS中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.2 支架形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察及成分鑒定 肉眼觀察去細(xì)胞肌肉的形態(tài)。去細(xì)胞肌肉用4%多聚甲醛PBS固定1 h，5%蔗糖90 min，15%蔗糖90 min，30%蔗糖過(guò)夜以梯度脫水，OCT包埋，冷丙酮速凍，之后放入-70℃冰箱保存。恒冷箱切片機(jī)切片，HE 染色，觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。此外對(duì)切片進(jìn)行Van Gienson(VG)染色和 Weigert染色(VG+ET染色)檢測(cè)支架的細(xì)胞外基質(zhì)成分。
1.2.3 人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng) 人羊膜上皮細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素，200 μg/ml的谷氨酰胺)，37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待單層培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，傳代培養(yǎng)。
1.2.4 人羊膜上皮細(xì)胞與去細(xì)胞肌肉支架相容性的鑒定
1.2.4.1 取生長(zhǎng)良好的人羊膜上皮細(xì)胞，80%細(xì)胞接近融合，棄去培養(yǎng)液，0.25%胰蛋白酶消化，當(dāng)胞體回縮，細(xì)胞間隙變寬時(shí)，用血清終止消化，反復(fù)輕吹瓶壁細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液于離心管中，1 000 r/min，離心3 min。用DMEM重懸細(xì)胞。用1 ml注射器吸入細(xì)胞懸液，以2×106/ml 密度注入去細(xì)胞肌肉支架中分裝至24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，培養(yǎng)1 w。摻入Brdu(終濃度為10 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，恒冷箱切片機(jī)切片(方法同前)。切片經(jīng)PBS 洗后，3% H2O2滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min，血清封閉20 min;一抗用BrdU(1∶1 000稀釋)單克隆抗體，BDNF和NT3多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃孵育過(guò)夜，PBS 洗后，二抗37℃孵育30 min，PBS 洗后，SABC37℃孵育30 min，DAB顯色。光鏡下觀察。
1.2.4.2 掃描電子顯微鏡鑒定羊膜上皮細(xì)胞在去細(xì)胞肌肉支架上的生長(zhǎng)情況 取生長(zhǎng)良好的人羊膜上皮細(xì)胞，80%細(xì)胞接近融合時(shí)，用上述方法消化下來(lái)后，把羊膜上皮細(xì)胞種植到去細(xì)胞肌肉支架中，放在24孔板中，在37℃、5 % CO2及飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后，用2%戊二醛固定后，梯度乙醇脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，鍍膜，采用掃描電子顯微鏡觀察并拍照。
2 結(jié) 果
2.1 支架的組織結(jié)構(gòu)與成分 去細(xì)胞肌肉外觀呈乳白色,半透明,質(zhì)地柔軟。從大體上看，肌肉去細(xì)胞前后整體大小與形狀無(wú)顯著變化。支架縱切面的HE染色觀察可見骨骼肌細(xì)胞成分消失,而纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)保持完整，支架內(nèi)主要為平行管道。VG+ET染色證明支架成分主要為膠原纖維和彈力纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分，膠原纖維為紅色波浪狀結(jié)構(gòu)，彈性纖維為藍(lán)色絲狀結(jié)構(gòu)，見圖1。
2.2 羊膜上皮細(xì)胞與去細(xì)胞肌肉支架的兼容性 見圖2，HE染色顯示人羊膜上皮細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)良好，分布均勻(圖
圖1 去細(xì)胞肌肉支架大體與組織切片染色
圖2 去細(xì)胞肌肉支架的病理圖片2A)。免疫組化染色顯示，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目多，提示支架中的人羊膜上皮細(xì)胞有增殖能力(圖2B)�？筃T3和BDNF染色顯示，支架中的人羊膜上皮細(xì)胞含有NT3、BDNF陽(yáng)性顆粒，呈棕褐色分布在細(xì)胞質(zhì)中(圖2C，2D)。JSM5600LV掃描電子顯微鏡顯示，在支架內(nèi)部分布有大量細(xì)胞，細(xì)胞在支架中分布比較均勻，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖2E)。
3 討 論
理想的支架材料應(yīng)與細(xì)胞外基質(zhì)類似，與活體細(xì)胞有良好的生物相容性〔7，8〕。去細(xì)胞肌肉作為治療神經(jīng)損傷的生物工程支架材料有如下優(yōu)勢(shì)：(1)去細(xì)胞肌肉的細(xì)胞外基質(zhì)成分對(duì)組織細(xì)胞的'遷移、黏附、生長(zhǎng)代謝都有重要作用，研究表明再生的軸突可以很好的黏附在去細(xì)胞肌肉支架上〔9〕。(2)去細(xì)胞肌肉的排列結(jié)構(gòu)與神經(jīng)膜管類似,僅在直徑上略大于神經(jīng)膜管〔10〕，它們提供了軸突可生長(zhǎng)穿過(guò)的足夠空間〔9〕，該結(jié)構(gòu)對(duì)于誘導(dǎo)神經(jīng)軸突再生是十分重要的。 Fansa等比較了接種施萬(wàn)細(xì)胞的不同去細(xì)胞生物材料(肌肉，靜脈，神經(jīng)外膜)橋接缺損的外周神經(jīng)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)缺乏神經(jīng)膜管樣結(jié)構(gòu)的去細(xì)胞肌肉支架(靜脈和神經(jīng)外膜支架)中的再生軸突是無(wú)序和排列混亂的，而有神經(jīng)膜管樣結(jié)構(gòu)的去細(xì)胞肌肉支架中的再生軸突是有序排列的〔11〕。這種軸突再生的有序性對(duì)神經(jīng)損傷的軸突再生同樣也是十分重要的。(3)去細(xì)胞肌肉引起的免疫排斥反應(yīng)較小〔9，12〕。這些優(yōu)勢(shì)都說(shuō)明去細(xì)胞肌肉可作為治療神經(jīng)損傷的理想的材料。本研究采用的制作去細(xì)胞肌肉的方法主要用來(lái)減少異種移植材料的免疫排斥反應(yīng)。該方法能有效的去除脂膜和膜相關(guān)抗原以及可溶性蛋白，并能有效的保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的原始空間結(jié)構(gòu)。肌細(xì)胞正常呈平行分布，其細(xì)胞外基質(zhì)成分也是平行分布的，從支架縱切面的結(jié)果看支架的纖維成分也是平行排布的，VG+ET染色結(jié)果顯示細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分膠原纖維和彈性纖維保持完好。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)此方法可成功制備去細(xì)胞肌肉支架。
由于單獨(dú)應(yīng)用去細(xì)胞肌肉支架治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的效果有限〔13〕，去細(xì)胞肌肉的生物相容性也有待驗(yàn)證。本研究用人羊膜上皮細(xì)胞作為種子細(xì)胞種入去細(xì)胞肌肉支架以探討其相容性。研究表明，羊膜上皮細(xì)胞中含有多種生物活性因子，包括黏蛋白、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、前列腺素E、表皮生長(zhǎng)因子樣物質(zhì),IL1，IL8 等因子，另外，還可分泌BDNF和NT3等重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子〔4〕。其中層黏蛋白、BDNF和NT3等生物活性因子對(duì)神經(jīng)損傷的治療具有十分重要的作用。羊膜上皮細(xì)胞可作為一種較理想的種子細(xì)胞，與去細(xì)胞肌肉支架結(jié)合可能成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一個(gè)理想的組織工程材料。本實(shí)驗(yàn)觀察到人羊膜上皮細(xì)胞在去細(xì)胞肌肉支架中分布均勻，抗BrdU、BDNF及NT3免疫組化顯示去細(xì)胞肌肉支架中羊膜上皮細(xì)胞有良好的增殖能力，并能表達(dá)BDNF和NT3，說(shuō)明羊膜上皮細(xì)胞在去細(xì)胞肌肉支架中保持了良好的生物學(xué)活性。以上結(jié)果一方面證明了本研究制作的去細(xì)胞肌肉支架有良好的生物相容性，另一方面為應(yīng)用羊膜上皮細(xì)胞和去細(xì)胞肌肉支架結(jié)合治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
總之 ，本研究成功制備了去細(xì)胞肌肉支架，并證實(shí)人羊膜上皮細(xì)胞在去細(xì)胞肌肉支架中能分泌重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，人羊膜上皮細(xì)胞與去細(xì)胞肌肉支架橋接體為神經(jīng)缺損再生提供了基底膜、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等種種有利因素，構(gòu)成了良好的神經(jīng)再生微環(huán)境，有利于使神經(jīng)缺損得到較好地修復(fù)，為進(jìn)一步研究羊膜上皮細(xì)胞與去細(xì)胞肌肉支架橋接體治療神經(jīng)損傷奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
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