公衛(wèi)執(zhí)業(yè)醫(yī)師考點：炭疽診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則—附錄A
炭疽細菌學(xué)檢查
A1 標(biāo)本的采取
A1.1 采取標(biāo)本時必須遵循的兩條原則
A1.1.1 盡可能在抗生素治療開始前采取標(biāo)本。
A1.1.2 除必要時并在具備操作病毒細菌條件的實驗室內(nèi)，不得用解剖的方式獲取標(biāo)本。所需的血液與組織標(biāo)本，均應(yīng)以穿刺方式取得。
A1.2 血液標(biāo)本
所有的疑似人類病例和病畜，都應(yīng)采取血液標(biāo)本，標(biāo)本量至少應(yīng)滿足下列檢查的需要：
a)涂片進行顯微鏡檢查;
b)接種培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng);
c)分離血清檢查抗體;
d)常規(guī)血液檢查。
A1.3 糞便與嘔吐物標(biāo)本
表現(xiàn)消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標(biāo)本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無菌容器中。
A1.4 痰與咳碟標(biāo)本
表現(xiàn)為呼吸道癥狀的可疑病人應(yīng)收集其痰液標(biāo)本，無痰液者，應(yīng)取供細菌分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，打開平皿蓋置病人口鼻10cm處;令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。
A1.5 腦脊液標(biāo)本
表現(xiàn)腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液，標(biāo)本量參照A1.2的要求。
A1.6 尸體標(biāo)本
食草動物死于炭疽時，通常會從口、鼻、肛門等腔道開口流出血液，這種血液應(yīng)是首先采取的標(biāo)本。如果血液已滲入土壤，則應(yīng)收集混有血液的土壤作為標(biāo)本。沒有血液流出，或已不可能獲取血液標(biāo)本時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)性臟器獲得組織標(biāo)本。
A1.7 肉類標(biāo)本
如果懷疑罹患炭疽的家畜已被宰殺，或?qū)ι唐啡忸愡M行常規(guī)檢查時，可剪取小塊肉類標(biāo)本。如有可能，特別應(yīng)剪取肝臟、脾臟等富含血液以及含淋巴組織的標(biāo)本。
A1.8 毛皮或其他可疑污染物品標(biāo)本
剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無菌試管內(nèi)，加適量無菌生理鹽水浸泡。
A1.9 水標(biāo)本
檢查水體污染時，用廣口瓶收集水樣。如須取深層水樣時，將帶蓋廣口瓶伸入水中，然后將用繩系住的瓶蓋提起。
A1.10 土壤標(biāo)本
在牲畜死亡或宰殺的地點，應(yīng)取土壤標(biāo)本以供檢查。
A2 顯微鏡檢查
所有來自病人、病畜或尸體的標(biāo)本，都應(yīng)首先進行顯微鏡檢查。
A2.1 復(fù)合負染法
將標(biāo)本或懸液滴在載玻片上，立即加等量的炭素墨水，混勻推片。待干燥后滴加95%乙醇數(shù)滴，干燥后再以1%結(jié)晶紫液染1min，用水沖洗，干后用油鏡檢查。如果發(fā)現(xiàn)在細菌與炭素顆粒之間存在明顯的、連續(xù)的間隔帶，即說明細菌的周圍存在莢膜。
液體標(biāo)本(如血液、腦脊液)和懸液標(biāo)本(如糞便或混有血液的土壤)在能夠采取標(biāo)本后立即進行顯微鏡檢查的情況下，推薦使用復(fù)合負染法。
A2.2 莢膜染色法
將標(biāo)本涂片或印片干燥，妥善包裝后帶回實驗室，按常規(guī)方法固定，以美藍染液染色3～5min(如莢膜不清晰，染色時間可稍延長)，水洗、干后鏡檢。菌體呈藍色，而莢膜呈紅色。
組織印片標(biāo)本，或制片后無法立即進行顯微鏡檢查，或進行大面積普查時，推薦使用莢膜染色法。
A2.3 顯微鏡檢查結(jié)果判定
來自病人、病畜或尸體的標(biāo)本中如發(fā)現(xiàn)由較寬的莢膜環(huán)繞的、兩端平齊的粗大桿菌，特別是鏡下發(fā)現(xiàn)大量、純一通常呈竹節(jié)狀的該種細菌，而且沒有明顯的其他細菌污染時，炭疽的診斷便可確立。
A3 細菌分離培養(yǎng)
A1 中所列的全部標(biāo)本，均應(yīng)進行細菌分離培養(yǎng)。
A3.1 培養(yǎng)基
炭疽芽孢桿菌的分離培養(yǎng)應(yīng)同時用兩種培養(yǎng)基進行：常規(guī)的血瓊脂平板和選擇性平板。后者按如下處方配制：
蛋白胨 2g EDTA 0.03g
氯化鈉 0.5g 乙酸亞鉈 0.004g
醇母浸膏粉 0.5g 水楊素 1g
0.2%溴麝香草酚藍(BTB) 1.2mL 瓊脂粉 1.8g
加蒸餾水至100mL，調(diào)pH至7.6，121℃滅菌20min，冷卻至45～50℃時，加入：多粘菌素B(3000u/mL水溶液)0.1mL，溶菌酶(30000u/mL水溶液)0.1mL，混勻后傾注平板。
A3.2 標(biāo)本處理
在正常情況下應(yīng)當(dāng)無菌的標(biāo)本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1mL，組織標(biāo)本應(yīng)先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以白金耳涂開。
所有污染的和陳舊的標(biāo)本，均應(yīng)首先制成懸液。根據(jù)標(biāo)本中含菌量的多少，可將懸液適當(dāng)稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再3000r/min離心30min，取富集的沉淀物。將所得的懸液67℃加熱15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1mL。
A3.3 挑選可疑菌落
上述平板在37℃孵育過夜或24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽孢桿菌菌落。
炭疽芽孢桿菌在血瓊脂平板上的形態(tài)為：灰白色、不透明、中等大小，常不規(guī)則，表面呈毛玻璃樣，周圍無溶血環(huán)。
炭疽芽孢桿菌在選擇平板上菌落較血瓊脂平板上為小，具有類似表面特征，菌落呈藍綠色。但是，若遇菌落形態(tài)與以上描述完全一致但呈黃色的菌落，也應(yīng)進行A4的鑒定步驟。
A4 炭疽芽孢桿菌鑒定
將上述可疑菌落挑出，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板之上，在劃線區(qū)內(nèi)分別貼上浸有診斷用炭疽芽孢桿菌噬菌體和青霉素的紙片。37C孵育過夜或24h后，在兩種紙片的周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)，便可判定為炭疽芽孢桿菌。在病人、病畜或尸體中分離獲得炭疽芽孢桿菌，炭疽的診斷便可確立。
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