公衛(wèi)執(zhí)業(yè)醫(yī)師考點(diǎn)：包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)附錄C

　　人體包蟲病免疫學(xué)診斷方法有間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、PVC薄膜快速ELISA等。其中，以ELISA法最為常用且較敏感�，F(xiàn)有的包蟲病免疫學(xué)試驗(yàn)方法在敏感性和特異性上存在很大的差異。試驗(yàn)結(jié)果受許多因素的影響：抗原的性質(zhì)和質(zhì)量;檢測(cè)用的試驗(yàn)系統(tǒng);棘球蚴囊的數(shù)量、部位和活力;不同地理蟲株差異;個(gè)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異等。約10%～40%的手術(shù)確診的包蟲病患者用目前已知的抗原檢測(cè)不到特異性抗體。本規(guī)范中列出了國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的一些方法。

　　C.1 抗原制備

　　C.1.1囊液粗抗原：完整的棘球蚴組織表面清洗干凈消毒后，無菌抽取囊液(宜使用無化膿和無鈣化的可育囊)。將囊液經(jīng)5000 r/min離心20 min，上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

　　C.1.2 純化抗原

　　可用磷鎢酸、氯化鎂沉淀法對(duì)棘球蚴囊液抗原進(jìn)行部分純化。取20ml離心后的囊液上清，加入2mol/L MgCl2和4%磷鎢酸(用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5～7.6)各1.2ml;室溫?cái)嚢? min，5000r/min 離心30 min;將沉淀用0.02mol/LpH7.2 PBS溶解;4oC 透析24小時(shí)，測(cè)定蛋白濃度，～20 oC凍存。

　　C.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

　　C.2.1 抗原

　　囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原。

　　C.2.2 操作方法

　　C.2.2.1 抗原包被：用0.05 mol/L pH9.6碳酸緩沖液稀釋抗原至工作濃度，每孔加入100 μl，置溫盒4℃過夜。次日，傾去抗原，用含0.05%吐溫～20的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L .pH7.4 PBST)洗滌3次，每次3 min，拍干;

　　C.2.22 加待檢血清：血清用含3%BSA的PBST 1∶200稀釋，每孔加入100 μl，每板應(yīng)設(shè)參考陽性一孔，參考陰性三孔及PBS對(duì)照一孔。置溫盒，37℃ 1 h，取出傾去血清，同前洗滌3次;

　　C.2.2.3加酶標(biāo)記第二抗體：加入工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG 100 μl，37℃，1 h，傾去第二抗體，同前洗滌;

　　C.2.2.4 加底物顯色：加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS，藍(lán)色)底物溶液100 μl，37℃，30 min;

　　C.2.2.5 加終止液：2 mol/L . H2SO4 50 μl.

　　C.2.3 結(jié)果判斷

　　在酶標(biāo)儀上讀取492 nm(OPD)或450 nm(TMB/TMBS)吸光值，以待測(cè)樣本(S)對(duì)陰性對(duì)照血清(N)的S/N≥2.1為陽性臨界值。

　　C.3 間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(IHA)

　　C.3.1 紅細(xì)胞醛化

　　C.3.1.1 從綿羊頸靜脈無菌采血100ml，加入200ml～400ml阿氏液(400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2g、NaCI 1.68g、檸檬酸三鈉2.4g和檸檬酸0.22g，調(diào)pH至6.1，高壓或過濾除菌)中，混勻抗凝。3000 r/min離心15 min，棄上清;

　　C.3.12 用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞3次，同上離心。沉淀中加入50ml生理鹽水和100ml PBS(0.15 mol/L ，pH8.0)混勻;

　　C.3.13 加入經(jīng)10% Na2CO3中和的戊二醛300ml(10% Na2CO3 75ml與25%戊二醛225ml混合)于磁力攪拌器4℃緩慢攪拌24 h;

　　C.3.14+ 離心棄上清，沉淀用生理鹽水洗滌5次。最后，將紅細(xì)胞沉淀用含0.1% NaN3的生理鹽水配成10%細(xì)胞懸液，4℃保存。

　　C.3.2 紅細(xì)胞致敏

　　C.3.2 1.將10%戊二醛醛化的綿羊紅細(xì)胞20ml 用生理鹽水300ml 洗3次(3000 r/min，5 min)，紅細(xì)胞壓積約為2ml;

　　C.3.2 .2加入生理鹽水98ml，將紅細(xì)胞配成2%懸液100ml;

　　C.3.2. 3與1：10000鞣酸100ml混合于37 oC水浴30 min，每10 min混旋一次;

　　C.3.2. 4同步驟1離心洗3次，棄上清;

　　C.3.2. 5沉淀加入生理鹽水198ml，將鞣化紅細(xì)胞配成1%懸液200ml;

　　C.3.2. 6.與稀釋好的囊液抗原200ml 混合，37 ℃水浴30 min，每10 min混旋一次;

　　C.3.2. 7離心棄上清，用1%兔血清PBS(0.15 mol/L pH7.2 PBS)洗3次，棄上清;

　　C.3.2. 8 用10%兔血清PBS 18ml將紅細(xì)胞配成10%致敏紅細(xì)胞20ml.置4℃冰箱保存。

　　C.3.3 操作方法

　　C.3.3.1 準(zhǔn)備抗原：用0.15 mol/L pH7.2 PBS將10%致敏紅細(xì)胞保存液稀釋至1%備用;

　　C.3.3.2血凝板每孔加入25 μl PBS;

　　C.3.3.3第一孔加入待檢血清25 μl，用移液器或稀釋棒從第一孔開始逐孔向后稀釋;

　　C.3.3.4每孔加1%致敏紅細(xì)胞25 μl，振蕩混合3 min，置37℃反應(yīng)1h，判定結(jié)果;

　　C.3.3. 5.對(duì)照設(shè)置：每批試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置陽性、陰性和紅細(xì)胞對(duì)照(紅細(xì)胞對(duì)照孔只有PBS和致敏紅細(xì)胞)。

　　C.3.4 結(jié)果判斷

　　C.3.41 陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞全部沉入孔底呈點(diǎn)狀，邊緣光滑;

　　C.3.42陽性反應(yīng)：++++ 100%紅細(xì)胞凝集;+++ 75%紅細(xì)胞凝集;++ 50%紅細(xì)胞凝集;+ 25%紅細(xì)胞凝集。

　　以血清1∶128稀釋出現(xiàn)陽性反應(yīng)者(++)判為血清抗體陽性。

　　C.4 PVC薄膜快速ELISA

　　C.4.1 抗原

　　囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原

　　C.4.2 操作方法

　　C.4.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜軟板，編號(hào)，用PBST洗1次，然后每孔加PBST 200 μl;

　　C.4.2.2 加待檢血清及參考血清(每板作陰性對(duì)照一孔、陽性對(duì)照一孔)每孔10 μl，混勻，置濕盒37℃ 5 min(或25℃室溫10 min)。傾去血清，用PBST連續(xù)洗8次，甩干;

　　C.4.2.3加酶標(biāo)抗體：每孔加工作濃度酶標(biāo)抗體 200 μl，37℃ 5 min，同上洗滌8次，再加蒸餾水洗一次，甩干;

　　C.4.2.4 加底物顯色：每孔加TMB底物200 μl，反應(yīng)5 min～10 min(TMB底物溶液的制備：TMB 50 mg溶于10ml二甲基亞砜中作為母液，4℃保存。用前取母液1ml+pH 5.0檸檬酸緩沖液50ml+30% H2O2 8 μl)。

　　C.4.3 結(jié)果判斷

　　參照陰性及陽性對(duì)照，用目視法判斷結(jié)果。陰性基本無色，陽性為鮮藍(lán)色。

　　C.5 免疫印跡技術(shù)(Western blot，WB)

　　C.5.1 抗原膜制備

　　囊液粗抗原、原頭節(jié)粗抗原或特異性純化抗原進(jìn)行常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳，分離膠濃度為15%，抗原蛋白經(jīng)SDS～PAGE電泳分離后，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。經(jīng)Ponceau S染色，標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)分子量位置。將抗原膜用封閉液(3%脫脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐溫～20)封閉1 h后將膜裁成寬2-3 mm的膜條備用。此抗原膜條，可夾在PBS濕濾紙中封于塑料袋內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆�。若置低溫冰箱中，可長(zhǎng)期保存。

　　C.5. 2 操作方法

　　C.5.2.1 將抗原膜置于反應(yīng)槽中，加入用封閉液(3 %脫脂奶粉，0.15 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.02%吐溫～20)1：100稀釋的待檢血清，每批試驗(yàn)應(yīng)設(shè)參考陽性、陰性和PBS對(duì)照。室溫振搖2 h(4℃可過夜)。次日，用上述封閉液洗4次，每次5 min;

　　C.5.2.2加入工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG，室溫2 h，同前洗滌;

　　C.5.2.3加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB，棕色)顯色至清晰后，蒸餾水終止反應(yīng)，將反應(yīng)膜干燥保存。

　　C.5.3 判讀結(jié)果

　　細(xì)粒棘球蚴特異性反應(yīng)條帶：8 kDa、16 kDa、20-24 kDa(AgB)和38 kDa(Ag5)

　　多房棘球蚴特異性反應(yīng)條帶：18 kDa(Em18)、54 kDa(Em2)和220 kDa(EmAP)

　　C.6 循環(huán)抗原檢測(cè)(circulating antigen，cAg)

　　C.6.1 特異性單克隆或多克隆抗體的制備

　　C.6.1.1用粗抗原或特異性抗原免疫Balb/c小鼠，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合、陽性細(xì)胞克隆篩選和鑒定，將分泌特異性單克隆抗體的細(xì)胞株腹腔注射小鼠，獲得單克隆抗體腹水;

　　C.6.1.2 用粗抗原或特異性抗原免疫兔，獲得高效價(jià)的多克隆抗體;

　　C.6.1.3建立可檢測(cè)粗抗原或特異性抗原的敏感的雙抗體夾心ELISA方法;

　　C.6.1.4用建立的雙抗體夾心ELISA反應(yīng)系統(tǒng)檢測(cè)病人血清中的cAg.

　　C.6.2 循環(huán)抗原檢測(cè)

　　C.6.2.1 將特異性單克隆抗體或多克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板，每孔100 μl，4℃過夜后用PBST洗板3次;

　　C.6.2.2每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl，于37℃封閉1 h，洗板3次;

　　C.6.2.3 待檢血清用上液1∶2稀釋，每孔加100 μl，37℃溫育1h，洗板3次;

　　C.6.2.4 加工作濃度的酶標(biāo)記第二抗體(特異性單抗或多抗)100 μl 37℃ 1h后，洗板3次;

　　C.6.2.5 加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS，藍(lán)色)底物溶液100 μl，37℃，30 min;

　　C.6.2.6 加入50 μl 2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng);

　　C.6.2.7 酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值;

　　C.6.2.8 對(duì)照設(shè)置和結(jié)果判定：每板設(shè)陽性對(duì)照一孔(1 μg/ml抗原100 μl)，陰性血清對(duì)照三孔，以陰性對(duì)照OD均值+3SD或S/N≥2.0為陽性臨界值。

　　C.7 循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)(circulating immune complex，CIC)

　　C.7.1 檢測(cè)CIC中的循環(huán)抗原

　　C.7.1.1. 用0.01 mol/L pH8.4硼酸鹽緩沖液將PEG6000配成7%溶液，取此液100 μl加等量1∶2待檢血清混合置室溫下1h后，5000 r/min離心1 h;

　　C.7.1.2 吸去上清液，在沉淀中加含有8 mol/L 尿素的0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液0.5ml，溶解沉淀物;

　　C.7.1.3. 用此液包被酶標(biāo)板每孔100 μl，每份標(biāo)本包被兩孔，4℃過夜后，洗板3次(陽性及陰性對(duì)照同樣處理);

　　C.7.1.4. 每孔加含有2%BSA的PBST 100 μl，37℃封閉1 h，洗板3次;

　　C.7.1.5. 加入HRP標(biāo)記的工作濃度特異性單抗或多抗100 μl，37℃下1h后洗板3次;

　　C.7.1.6 加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS，藍(lán)色)底物溶液100 μl，37℃，30 min.

　　C.7.1.7. 加入2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng);

　　C.7.1.8 酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值;

　　C.7.1.9 對(duì)照設(shè)置和結(jié)果判定：每板設(shè)陽性對(duì)照一孔(1 μg/ml抗原100 μl)，陰性血清對(duì)照三孔，以陰性對(duì)照OD均值十3 SD為陽性臨界值。

　　C.7.2 檢測(cè)CIC

　　C.7.2. 1 特異性抗體的制備同C.6.1;

　　C.7.2.2 將特異性單克隆抗體或多克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板，每孔100 μl，4℃過夜后用PBST洗板3次;

　　C.7.2.3 每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl，于37℃封閉1 h，洗板3次;

　　C.7.2.4 待檢血清用上液1∶20稀釋，每孔加100 μl，37℃溫育1h，洗板3次;

　　C.7.2.5 加工作濃度的酶標(biāo)記抗人IgG或IgM 100 μl 37℃ 1h后，洗板3次;

　　C.7.2.6加鄰苯二胺(OPD，橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS，藍(lán)色)底物溶液100 μl，37℃，30 min.

　　C.7.2.7加入2mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng);

　　C.7.2.8酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值;

　　C.7.2.9對(duì)照設(shè)置和結(jié)果判定：每板設(shè)陽性對(duì)照一孔(人工復(fù)合物)，陰性血清對(duì)照三孔，以陰性對(duì)照OD均值+3SD或S/N ≥2.0為陽性臨界值。

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