內(nèi)皮抑素的表達(dá)與直腸癌侵襲行為的關(guān)系

　　Relationship between endostatin expression　and the invasion of rectal cancer

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the relation of endostatin (ES) and the vascular formation in rectal cancer, and the effect of ES on the invasion of rectal cancer. Methods  The expression level of ES and microvessel density (MVD) in 10 cases of normal rectal tissues and 40 cases of rectal cancer were detected by immunohistochemistry staining. Results  The expression level of ES in normal rectal tissues was obviously stronger than that in rectal cancer (P<0.05). There was a negative relation between the expression level of ES and MVD in rectal cancer with the changes of the depth of infiltration and lymph node metastasis (P<0.05). Conclusion  With the decrease of ES, the number of knubbly vessels increases. The decrease of ES can promote infiltration of rectal cancer and metastasis of lymph node.

　　KEY WORDS: endostatin; microvessel density; rectal cancer

　　新近研究表明，血管生成在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移中具有重要作用，血管生成的啟動(dòng)是腫瘤微環(huán)境中血管生成刺激因子和抑制因子平衡改變的結(jié)果。內(nèi)皮抑素(endostatin, ES)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤血管生成的一種細(xì)胞因子，為ⅩⅧ型膠原C?末端的184個(gè)氨基酸片段，能通過(guò)誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、阻斷血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性等多種途徑抑制新生血管生長(zhǎng)，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤微血管密度(microvessel density, MVD)是判斷腫瘤血管生成的定量指標(biāo)[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)直腸癌組織中ES蛋白的表達(dá)與MVD，探討 ES與直腸癌血管形成的關(guān)系以及在直腸癌侵襲行為中的作用。

　　1  材料與方法

　　1.1  臨床資料  選取我院1999-2002年間直腸癌切除術(shù)后的石蠟包埋組織40例，其中男性16例、女性24例，年齡20-75歲，平均年齡55歲。正常直腸組織10例為對(duì)照。按Dukes分期A期7例，B期15例，C期18例。

　　1.2  檢測(cè)方法  采用免疫組織化學(xué)SP法。鼠抗人ES單克隆抗體、鼠抗人CD34單克隆抗體和免疫組織化學(xué)染色試劑盒(SP kit) 均購(gòu)自福州邁新公司。按試劑盒說(shuō)明書所示步驟進(jìn)行操作。

　　1.3  結(jié)果判定  ES陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，呈棕黃色。依據(jù)高倍鏡視野下(×400)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比例進(jìn)行評(píng)分。1分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞為5%-20%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞為21%-50%；4分：陽(yáng)性細(xì)胞>50%。MVD的測(cè)量方法：在高倍鏡視野下(×400)隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野的被CD34染成棕黃色的血管數(shù)目，取其平均值作為MVD，每一個(gè)與鄰近的微血管明顯分離的陽(yáng)性染色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為獨(dú)立的微血管。

　　1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差 分析 ，相關(guān)分析采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2  結(jié)果

　　2.1  正常直腸組織與直腸癌組織中ES的表達(dá)及MVD  ES陽(yáng)性表達(dá)主要在正常直腸黏膜組織。直腸癌組織中邊緣區(qū)細(xì)胞ES染色要強(qiáng)于中心區(qū)，一些壞死組織周邊區(qū)也可見到強(qiáng)陽(yáng)性染色出現(xiàn)。直腸癌組織的MVD明顯高于正常黏膜組織(P<0.05，表1)。

　　表1  正常直腸組織與直腸癌組織中ES 的表達(dá)及MVD（略）

　　Table 1  The expression level of ES and MVD in normal rectal tissues and rectal cancer

　　*P<0.05 vs. normal rectal tissue

　　2.2  直腸癌組織中ES的表達(dá)、MVD與臨床病理特征的關(guān)系  依癌組織浸潤(rùn)深度分為黏膜層、肌層、全層三組，隨浸潤(rùn)深度的增加，直腸癌組織中ES表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.786, P<0.05)。直腸癌浸潤(rùn)越深，ES蛋白的表達(dá)越低，而MVD增加(表2)。

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　　表2  直腸癌的浸潤(rùn)深度與ES表達(dá)及MVD的關(guān)系（略）

　　Table 2  The effect of the expression level of ES and MVD on the depth of infiltration in rectal cancer

　　△P<0.05 vs. mucous membrane; *P<0.05 vs. mucous membrane and muscular layer

　　2.3  直腸癌組織中ES的表達(dá)、MVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系  按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移兩組，兩組間直腸癌組織中ES表達(dá)及MVD有顯著性差異(P<0.05，表3)。

　　表3  淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與ES表達(dá)及MVD的關(guān)系（略）

　　Table 3  The effect of the expression level of ES and MVD on the lymph node metastasis in rectal cancer

　　*P<0.05 vs. no lymph node metastasis

　　3  討論

　　腫瘤從靜止?fàn)顟B(tài) 發(fā)展 到伴隨血管新生的浸潤(rùn)狀態(tài)，其關(guān)鍵在于血管形成因子與血管形成抑制因子之間平衡狀態(tài)的改變[3]。在腫瘤組織中正是因?yàn)檫@種平衡狀態(tài)受到破壞，誘發(fā)新生血管的形成，構(gòu)成了腫瘤發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)。20世紀(jì)90年代初，F(xiàn)olkman[4]發(fā)現(xiàn)實(shí)體腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)以及轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管的形成。腫瘤血管生成的啟動(dòng)是多種因素的共同結(jié)果，通常是血管抑制調(diào)節(jié)因子失活或缺失，血管生長(zhǎng)刺激因子從基質(zhì)中釋放并作用于內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)果。近年來(lái)有關(guān)大腸癌血管形成因子的報(bào)道較多，包括成纖維生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等[5]。多數(shù) 研究 顯示腫瘤微血管生成與大腸癌的Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后等均有較密切的關(guān)系[6]。同時(shí)，許多惡性腫瘤也分泌血管生成抑制因子，包括血管抑素和血小板凝血酶敏感蛋白等。ES是一種特異的內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制劑，具有很強(qiáng)的抑制血管生成的作用[7]，可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡從而提高腫瘤細(xì)胞的凋亡速率。此外，它還通過(guò)其他途徑抑制腫瘤血管的生成，如直接抑制血管生長(zhǎng)和抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。ES特異性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的增加或細(xì)胞周期的改變有關(guān)[8]。ES通過(guò)抑制腫瘤血管的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤缺氧，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，直腸癌組織與正常直腸組織相比較，ES蛋白的表達(dá)明顯減少，MVD顯著增高。表明隨著血管生成抑制因子分泌的減少，腫瘤組織血管生成增加，提示新生血管的形成有利于癌腫的發(fā)生。這與相關(guān)研究結(jié)果一致[3,10]。腫瘤血管的形成具有一定的組織侵襲性，腫瘤細(xì)胞可沿新形成血管開啟的組織裂隙向外侵襲，侵蝕周圍組織。微血管密度越高進(jìn)入循環(huán)的瘤細(xì)胞數(shù)相對(duì)也較高,且這些腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)誘發(fā)微血管形成的能力也較強(qiáng)，故微血管密度高的腫瘤易發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。對(duì)大腸癌的研究證實(shí)，MVD與大腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有密切關(guān)系，MVD高的易發(fā)生轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)[11?12]，5年生存率相對(duì)較低。Tanigawa[13]對(duì)133例大腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)生存率超過(guò)6年的MVD均值是96±41，死于術(shù)后復(fù)發(fā)的MVD為133±45。用Cox風(fēng)險(xiǎn)模型多因素 分析 顯示MVD是有價(jià)值的獨(dú)立預(yù)后因素，進(jìn)一步研究表明MVD與大腸癌血源性轉(zhuǎn)移相關(guān)。MVD是大腸癌生物學(xué)行為重要相關(guān)因素，可預(yù)測(cè)患者轉(zhuǎn)移和早期死亡。Tomisaki[14]對(duì)175例原發(fā)性大腸癌研究也認(rèn)為MVD高的患者有血源性轉(zhuǎn)移傾向,易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，在直腸癌組織中，隨腫瘤浸潤(rùn)深度的增加及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生，ES表達(dá)降低，MVD升高，ES表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明ES下調(diào)引起微血管的形成，MVD升高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移，在直腸癌侵襲過(guò)程中起著重要作用。提示直腸癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移不僅與血管生成有關(guān)，同時(shí)亦與血管生成抑制因素有密切的關(guān)系。綜上所述，我們可以推測(cè)，運(yùn)用外源性ES來(lái)阻斷腫瘤血管的生成，可以起到抑制直腸癌腫瘤組織生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。有報(bào)道用外源性的ES 治療 膀胱癌[15]、結(jié)腸癌[16]和胃癌[17]等惡性腫瘤，臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明能明顯縮小腫瘤，并能阻止癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。隨著研究的深入，ES可能在直腸癌的基因治療方面發(fā)揮一定的作用，用其配合常規(guī)的手術(shù)、化療、放療和免疫治療,將會(huì)進(jìn)一步提高腫瘤的治療效果。

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