大鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)與內(nèi)耳膜迷路獲取技術(shù)
掌握內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)，是開展內(nèi)耳病理學(xué)研究和組織化學(xué)研究以及分子生物學(xué)研究的必備手段，以下是小編搜集整理的一篇探究大鼠內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)的論文范文，歡迎閱讀查看。
大鼠作為動(dòng)物模型，被廣泛地應(yīng)用于內(nèi)耳研究中，包括化學(xué)制劑和重金屬的耳毒性研究，噪聲、沖擊波的損害性試驗(yàn)，以及各種原因所致聽力損失的治療研究等。盡管各種實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和目的不同，但都不可避免地需要觀察和評(píng)估大鼠內(nèi)耳的病理改變或者需要取出內(nèi)耳膜迷路結(jié)合分子生物學(xué)檢查方法評(píng)判某些特定基因或特殊蛋白質(zhì)的變化。因此，了解大鼠內(nèi)耳結(jié)構(gòu)、掌握大鼠內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)是開展內(nèi)耳研究的最基本訓(xùn)練科目之一。本文重點(diǎn)介紹大鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)及大鼠內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)，以期與同道交流，并為初學(xué)者提供參考經(jīng)驗(yàn)。
1大鼠內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)
大鼠內(nèi)耳位于顳骨內(nèi)，其骨性外殼被稱為骨迷路(BonyLabyrinth)(圖1A)，內(nèi)部包裹與骨迷路形狀相似的懸浮于外淋巴液中的膜迷路(MembranousLaby?rinth)(圖1B)。內(nèi)耳可分為前部的耳蝸(Cochlea)和后部的前庭(Vestibule)兩部分。
1.1耳蝸
大鼠骨性耳蝸是一個(gè)中空盤旋2.2周的螺旋形骨管，其中心的蝸軸(modiolus)在大鼠正常頭位時(shí)指向前下方。為描述方便，我們暫且規(guī)定蝸尖朝上。蝸軸上呈螺旋狀發(fā)出的骨性螺旋板(osseousspirallami?na)自蝸底向頂部盤旋，向外與耳蝸基底膜(basilarmembrane)相接。在骨性螺旋板下方的蝸軸內(nèi)部有一個(gè)類似螺旋式盤旋的骨管，稱為蝸軸螺旋管(Rothenthal'sCanal)，其內(nèi)為螺旋神經(jīng)節(jié)(spiralgan?glion)，包括神經(jīng)元(SpiralGanglionNeurons,SGNs)、膠質(zhì)細(xì)胞、耳蝸傳入和傳出神經(jīng)纖維等(圖1C)。
SGNs可分為Ⅰ型和Ⅱ型。其中Ⅰ型SGNs約占傳入神經(jīng)元總數(shù)的90-95%,Ⅱ型SGNs約占傳入神經(jīng)元總數(shù)的5-10%[1,2].兩類傳入神經(jīng)纖維和傳出神經(jīng)纖維僅在穿出疆孔之前有施萬細(xì)胞包裹，進(jìn)入基底膜耳蝸螺旋器(Cortiorgan)的傳入和傳出神經(jīng)纖維均裸露不再有髓鞘包裹。其中Ⅰ型傳入神經(jīng)末梢與內(nèi)毛細(xì)胞(InnerHairCells,IHCs)建立突觸聯(lián)系，Ⅱ型傳入神經(jīng)末梢與外毛細(xì)胞(OuterHairCells,OHCs)相接(圖3A)。進(jìn)入IHCs下方的來自內(nèi)橄欖核耳蝸束神經(jīng)纖維的末梢與Ⅰ型傳入神經(jīng)纖維建立突觸聯(lián)系但并不與內(nèi)毛細(xì)胞直接接觸，而橫穿Corti隧道進(jìn)入外毛細(xì)胞下方的耳蝸上隧道傳出神經(jīng)纖維的末梢則與OHCs建立直接的突觸聯(lián)系。在一般情況下，一個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞與大約20個(gè)Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)末梢相聯(lián)系，而一根Ⅱ型傳入神經(jīng)纖維則與大約10個(gè)外毛細(xì)胞相聯(lián)系。因此不難根據(jù)毛細(xì)胞的數(shù)目對(duì)Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)總數(shù)和Ⅱ型螺旋神經(jīng)節(jié)總數(shù)做大致的推算[1,3].蝸軸螺旋管內(nèi)所有神經(jīng)纖維的另一端經(jīng)螺旋管內(nèi)側(cè)骨壁進(jìn)入蝸軸中心匯聚成聽神經(jīng)束，在內(nèi)聽道的底部向內(nèi)轉(zhuǎn)彎入顱。
由于外毛細(xì)胞的高度自耳蝸底回向頂回逐漸增加，內(nèi)、外毛細(xì)胞的靜纖毛長度也相應(yīng)變長，因此Cor?ti器的高度、寬度及質(zhì)量在耳蝸的不同部位并不相同，其受力后形變的程度(其倒數(shù)即為勁度)自然也不相同。小鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回逐漸變寬，但基底膜的寬度從耳蝸底回向頂回卻是逐漸變窄，這顯然與許多教科書中對(duì)耳蝸基底膜寬度描述明顯不同[6].大鼠耳蝸Corti器的寬度從耳蝸底回向頂回也是逐漸變寬，基底膜的寬度變化同樣是由寬變窄，但是并不像小鼠那樣明顯，這一點(diǎn)顯然既不同于教科書中對(duì)人類基底膜寬度變化的描述也不同于小鼠的基底膜寬度變化特征(圖2C)，因此，我們認(rèn)為Corti器的寬度、勁度和質(zhì)量才是造成耳蝸不同部位具有不同頻率響應(yīng)的關(guān)鍵因素，而并不完全取決于基底膜的寬度。
1.2前庭
大鼠的前庭由前庭池(vestibularcavity)和半規(guī)管(semicircularcanals)組成。前者位于內(nèi)耳中部，其外壁中部的卵圓窗(ovalwindow)被鐙骨底板及環(huán)韌帶封閉，上壁與上鼓室相隔，后壁與弓狀下窩相隔，內(nèi)壁與后顱窩相隔，下壁參與構(gòu)成巖骨底面顱底(圖1A)。在大鼠前庭池內(nèi)側(cè)骨壁的前下方有一個(gè)扁平的球囊(saccule)，后上方為啞鈴狀的橢圓囊(utricle)(圖1D、2A)。球囊的下方靠外經(jīng)聯(lián)合管(ductusreuni?ens)與蝸管相通，靠內(nèi)經(jīng)內(nèi)淋巴管(endolymphaticduct)與內(nèi)淋巴囊(endolymphaticsac)相通[7].開口于橢圓囊后壁下角的前庭導(dǎo)水管(vestibularaqueduct)也向內(nèi)與內(nèi)淋巴管匯合匯入內(nèi)淋巴囊。在球囊的內(nèi)側(cè)表面有一個(gè)處于矢狀面呈鉤形的球囊斑(maculasacculi)(圖2D、3B)，球囊斑的感覺上皮面對(duì)前庭池的外側(cè)壁，球囊斑的底部則緊貼前庭池的內(nèi)側(cè)骨壁(圖1D)。在橢圓囊的上部有一個(gè)處于冠狀面呈扇形的橢圓囊斑(maculautriculi)(圖2D、3C)，橢圓囊斑感覺上皮面朝向后方(圖1D、2A)，其底面的神經(jīng)纖維和毛細(xì)血管經(jīng)上篩斑(superiormaculacribrosa)骨壁小孔通向顱內(nèi)。在球囊斑和橢圓囊斑的表面均覆蓋著膠狀的耳石膜(otolithicmembrane)，耳石膜的表層覆蓋著結(jié)晶體樣的耳石層(otoconiallayer)。毛細(xì)胞的動(dòng)纖毛和靜纖毛插入到耳石膜內(nèi)，當(dāng)頭位發(fā)生直線加速運(yùn)動(dòng)時(shí)，耳石膜因慣性與囊斑產(chǎn)生相對(duì)位移造成毛細(xì)胞的纖毛彎曲，感覺上皮因此而產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)沖動(dòng)，從而產(chǎn)生身體直線加速運(yùn)動(dòng)的感覺[1,2].
大鼠的半規(guī)管位于前庭池后方。這三個(gè)相互垂直的呈2/3環(huán)的中空骨管分別是外半規(guī)管(lateralsemicircularcanal)、上半規(guī)管(superiorsemicircularcanal)和后半規(guī)管(posteriorsemicircularcanal)，三個(gè)半規(guī)管借5個(gè)開口與前庭池相通。外半規(guī)管向外側(cè)凸起，與水平面約成30°角，其壺腹端開口和單腳分別開口于前庭池外壁的上部和下部;上半規(guī)管垂直向上向后凸起，與水平面垂直，壺腹端開口于前庭池上壁的后部，上半規(guī)管的另一端與后半規(guī)管聯(lián)合構(gòu)成總腳開口于前庭后壁中部的內(nèi)角;后半規(guī)管向后向外凸起，與水平面幾乎平行，其壺腹端開口于前庭池下壁的內(nèi)角，另一端與上半規(guī)管聯(lián)合形成總腳。
大鼠的三個(gè)骨性半規(guī)管及其周圍菲薄的骨壁共同圍成一個(gè)開口朝向顱內(nèi)的球形空洞(圖1A)，內(nèi)容小腦絨球葉。三個(gè)膜性半規(guī)管內(nèi)充滿內(nèi)淋巴液，并借結(jié)締組織小梁懸浮固定在充滿外淋巴液的骨半規(guī)管內(nèi)。在三個(gè)膜性半規(guī)管凸側(cè)緣的壺腹內(nèi)各有一個(gè)與半規(guī)管走向垂直的壺腹嵴。壺腹嵴的表面布滿感覺毛細(xì)胞，毛細(xì)胞的動(dòng)纖毛(kinocilium)和靜纖毛(ste?reocilium)插入到壺腹嵴表面覆蓋的膠質(zhì)終帽(cupu?la)[1,2].當(dāng)動(dòng)物體位發(fā)生旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)時(shí)，與旋轉(zhuǎn)平面平行的半規(guī)管內(nèi)的壺腹嵴終帽就會(huì)與壺腹嵴產(chǎn)生最明顯的相對(duì)位移，使毛細(xì)胞的纖毛隨著終帽偏轉(zhuǎn)并因此產(chǎn)生角加速運(yùn)動(dòng)的感覺。雖然大鼠的外半規(guī)管壺腹嵴與人類、猴、豚鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同樣呈馬鞍形[3],但是大鼠的上半規(guī)管和后半規(guī)管壺腹嵴卻被從嵴中央13D-F)，這種結(jié)構(gòu)到底具有什么特殊的生理學(xué)意義，目前尚不清楚。
大鼠前庭各個(gè)感受器的結(jié)構(gòu)基本相同，分布在各個(gè)感受器表面的Ⅰ型或Ⅱ型感覺毛細(xì)胞的底層均為一層支持細(xì)胞(圖1D)。這些支持細(xì)胞形成了一道明顯的分界線，所有的前庭神經(jīng)纖維在穿越支持細(xì)胞之前都脫去髓鞘才能進(jìn)入到前庭感覺上皮區(qū)實(shí)現(xiàn)與毛細(xì)胞之間的突觸聯(lián)系。來自前庭神經(jīng)元的具有大神經(jīng)纖維特征的傳入神經(jīng)末梢以高腳酒杯的形態(tài)特征將形似“細(xì)頸花瓶”的Ⅰ型毛細(xì)胞自底部一直包裹到頸部;具有小神經(jīng)纖維特征的前庭神經(jīng)末梢則僅在細(xì)胞底部與柱狀的Ⅱ型毛細(xì)胞形成突觸聯(lián)系[1,2].支配或接受前庭上半規(guī)管壺腹嵴、外半規(guī)管壺腹嵴、橢圓囊斑以及球囊斑鉤部的神經(jīng)纖維均經(jīng)上篩斑匯聚到前庭上神經(jīng)束(圖1D)入顱，而支配或接受球囊斑主體部分和后半規(guī)管壺腹嵴的神經(jīng)纖維末梢則分別經(jīng)中篩斑和下篩斑匯聚到前庭下神經(jīng)束(圖2B)。
另外，球囊和橢圓囊還有一個(gè)最大的不同在于橢圓囊斑感覺上皮周圍具有豐富的暗細(xì)胞群，而球囊內(nèi)部卻沒有暗細(xì)胞(圖1D)。球囊因此而不能產(chǎn)生內(nèi)淋巴液，只能依靠從連合管接受由血管紋分泌的來自蝸管的內(nèi)淋巴液，其內(nèi)淋巴液的吸收則也只能通過內(nèi)淋巴管匯集到內(nèi)淋巴囊，這可能就是形成內(nèi)淋巴液縱向流動(dòng)循環(huán)的主要原因。與內(nèi)淋巴液縱向流動(dòng)循環(huán)截然不同的是，橢圓囊囊壁上的上皮細(xì)胞中含有大量的暗細(xì)胞，因此橢圓囊及三個(gè)半規(guī)管內(nèi)的內(nèi)淋巴液分泌和吸收大都以輻射流循環(huán)的方式來完成，也就是說，在橢圓囊和三個(gè)半規(guī)管壺腹內(nèi)的內(nèi)淋巴液主要由周圍的暗細(xì)胞分泌也由這些暗細(xì)胞吸收，這可能就是為什么破壞內(nèi)淋巴囊僅僅造成球囊和蝸管內(nèi)積水但是卻不能造成橢圓囊和半規(guī)管積水的重要原因[7].
2大鼠內(nèi)耳的解剖步驟
觀察大鼠內(nèi)耳的病理變化通�？梢圆扇★D骨切片和膜迷路取材及鋪片兩種方式。顳骨切片方法能夠顯示動(dòng)物內(nèi)耳的立體結(jié)構(gòu)，充分展示內(nèi)耳深部結(jié)構(gòu)各個(gè)終器之間的相對(duì)位置關(guān)系;既可以證明耳蝸和前庭毛細(xì)胞的病理學(xué)改變，也可以觀察位于螺旋管內(nèi)的螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和位于上篩斑和中篩斑骨壁內(nèi)側(cè)的'前庭上神經(jīng)元和前庭下神經(jīng)元病變，而且還可以評(píng)估血管紋、半規(guī)管、內(nèi)淋巴管及內(nèi)淋巴囊內(nèi)的病理學(xué)改變。膜迷路取材及鋪片方法除了能夠?qū)Ω鞲杏X終器提供全面完整地定量分析之外，還能為進(jìn)一步應(yīng)用分子生物學(xué)研究手段提供純粹的內(nèi)耳實(shí)驗(yàn)樣品，因此，膜迷路取材技術(shù)更有助于開展在基因水平和蛋白質(zhì)水平上的研究[8-12].自1966年Engstrom重新提倡使用耳蝸鋪片技術(shù)以來[13],許多研究者對(duì)耳蝸鋪片技術(shù)進(jìn)行了不斷改進(jìn)。我們于1979年在戴樹宏老師最早在中國舉辦的耳蝸鋪片學(xué)習(xí)班學(xué)會(huì)了Engstrom的經(jīng)典耳蝸軟鋪片技術(shù)，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上首先提出了改良耳蝸硬鋪片技術(shù)[14],隨后又拓展了耳蝸螺旋韌帶鋪片[15]和前庭各終器鋪片[16]乃至全內(nèi)耳膜迷路鋪片等一系列耳蝸膜迷路取材技術(shù)[17].由于不同動(dòng)物的內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)存在著一定差異，因此大鼠內(nèi)耳的取材步驟與豚鼠內(nèi)耳膜迷路取材并不相同[3].
我們通過總結(jié)先前積累的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，介紹兩種不同的大鼠內(nèi)耳膜迷路取材及鋪片技術(shù)如下。
大鼠內(nèi)耳取材技術(shù)可以分為不經(jīng)脫鈣的膜迷路取材方法和經(jīng)脫鈣的膜迷路取材方法。前者主要適用于內(nèi)耳膜迷路基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中對(duì)轉(zhuǎn)染基因標(biāo)記及轉(zhuǎn)化蛋白質(zhì)的觀察、各種熒光免疫組織化學(xué)觀察、以及為各種分子生物學(xué)研究提供不同的內(nèi)耳組織材料。后者雖然在顯微操作上相對(duì)容易，但由于脫鈣過程造成的酶蛋白失活和抗原抗體反應(yīng)減弱或丟失以及染色標(biāo)記褪色等問題，脫鈣后取材的方法大多僅適用于常規(guī)病理學(xué)檢查。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求和染色標(biāo)記步驟，樣品染色或標(biāo)記有時(shí)可能需要安排在組織固定之前有時(shí)需要安排在組織固定之后，這主要取決于標(biāo)記信號(hào)是否需要進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記以及標(biāo)記物能否在脫鈣過程中保存。例如琥珀酸脫氫酶不能耐受醛類化學(xué)固定劑，因而應(yīng)用四唑鹽法標(biāo)記琥珀酸脫氫酶就必須對(duì)耳蝸施行先灌流染色然后再固定，由于四唑鹽法產(chǎn)生的酶組織化學(xué)藍(lán)色甲臜(formazan)沉淀物可以耐受脫鈣處理，因此適合應(yīng)用脫鈣后取材的方法并按照軟鋪片的方法來制備樣品;然而經(jīng)轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的綠色熒光蛋白以及各種探針熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)大多不能耐受脫鈣，它們或者會(huì)在脫鈣過程中喪失抗原抗體反應(yīng)性，或者會(huì)在脫鈣過程中發(fā)生熒光信號(hào)的淬滅，因而對(duì)施行熒光免疫組織化學(xué)染色的樣品，我們主張采用不脫鈣的方法來制備樣品。
2.1硬鋪片法
將固定后的顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中。
在解剖顯微鏡下，用鑷尖刺破蝸尖骨壁，將分離針探入頂回螺旋韌帶與蝸殼之間并沿著螺旋韌帶的背側(cè)分離蝸殼，鼓室側(cè)蝸殼較薄，在確保蝸殼與螺旋韌帶完全分離后可以輕易摘除已分離的蝸殼;顳骨巖部側(cè)的蝸殼骨壁較厚，則需要先將螺旋韌帶與骨壁分離，然后再用剪刀剪除顳骨巖部側(cè)骨壁，直至暴露整個(gè)耳蝸膜迷路(圖4A、B)。用分離刀探入基底膜底面與骨性螺旋板之間的縫隙中，沿骨性螺旋板將基底膜從鼓階朝蝸管方向輕抬，使耳蝸基底膜與蝸軸分離，此過程可以從蝸尖開始逐漸向蝸底進(jìn)行或者從蝸底開始向蝸尖推進(jìn)。由于基底膜的表面沒有骨組織阻擋，分離開的基底膜朝著蝸管方向彎曲不會(huì)造成基底膜折斷，同時(shí)由于操作器械是從基底膜的背面向上抬，因此也不會(huì)造成Corti器的機(jī)械損傷。取出耳蝸膜迷路之后，可用顯微剪將螺旋韌帶剪除(圖5E)，也可以將基底膜的頂回、中回和底回分別切斷，然后再用分離刀沿著基底膜的外側(cè)緣將螺旋韌帶切下，最后用游絲鑷摘除覆蓋在Corti器表面的蓋膜(圖5F)并完成耳蝸基底膜鋪片(圖2C、3A)。
解剖前庭各個(gè)終器的方法是在摘除鐙骨底板后，沿著卵圓窗邊緣打開前庭池外壁充分暴露前庭池。在前庭池內(nèi)壁前下方可見鉤形的球囊斑，在前庭池的后上方可見扇形的橢圓囊斑，由于這兩個(gè)囊斑的表面均覆蓋著白色的耳石膜使之成為兩個(gè)囊斑的最醒目標(biāo)志，因此很容易辨認(rèn)。橢圓囊斑和上半規(guī)管及外半規(guī)管壺腹均位于面神經(jīng)管內(nèi)側(cè)深部。需要先打開面神經(jīng)管外側(cè)壁摘除面神經(jīng)，再打開面神經(jīng)管內(nèi)側(cè)骨壁才能充分暴露橢圓囊的囊斑和兩個(gè)膜壺腹(圖4B)。球囊斑與前庭池內(nèi)壁的附著較為緊密，需要用分離針探入球囊內(nèi)側(cè)壁和骨壁之間進(jìn)行分離，然后取下被分離的整個(gè)球囊。橢圓囊和上半規(guī)管、外半規(guī)管壺腹相對(duì)游離，與橢圓囊斑和外壺腹嵴及上壺腹嵴相聯(lián)系的神經(jīng)纖維從上篩斑表面的小孔進(jìn)入骨壁匯聚成前庭上神經(jīng)束，因此只要將橢圓囊斑和兩個(gè)膜壺腹進(jìn)入上篩斑的神經(jīng)纖維和血管在上篩斑處截?cái)嗑涂梢詫E圓囊斑和外半規(guī)管及上半規(guī)管壺腹取下。后半規(guī)管壺腹的位置埋藏在蝸管底回hook后方的骨壁深部(圖2A、B)，需要撬開周圍骨壁方可暴露，然后將后壺腹通向下篩斑的神經(jīng)纖維截?cái)嗉纯蓪⒑髩馗雇暾〕�。獲得所有前庭終器后，還需打開球囊和橢圓囊的囊膜并切除囊斑周圍多余的膜性組織，再用游絲鑷去除兩個(gè)囊斑表面覆蓋的耳石膜，使兩個(gè)囊斑表面的感覺毛細(xì)胞充分暴露。撕開三個(gè)膜壺腹充分暴露壺腹嵴，最后將囊斑和壺腹嵴的正面朝上鋪放在載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片(圖2D、3B-F)。
2.2軟鋪片法
經(jīng)過脫鈣處理，骨組織中原先含有的鈣鹽基質(zhì)被除去，由于原先堅(jiān)硬的骨組織變成了軟組織，因此脫鈣后施行膜迷路取材的難度要比不脫鈣取材容易。將顳骨置于盛有蒸餾水的玻璃皿中，以類似不脫鈣分離的解剖手法，先分離蝸殼與螺旋韌帶，由于骨組織經(jīng)脫鈣后已經(jīng)變軟，分離時(shí)需要將分離針沿著蝸殼和螺旋韌帶之間的間隙進(jìn)行分離，同時(shí)要注意防止撕扯骨壁，以免牽拉造成耳蝸?zhàn)冃味毫鸦啄�。暴露整個(gè)膜迷路后，用游絲鑷從聽神經(jīng)孔取下蝸軸。再用游絲鑷和分離刀將整條耳蝸基底膜按底回、中回和頂回截成三個(gè)片段(圖5A-C)。用游絲鑷夾持蝸軸，再用分離刀沿著基底膜的內(nèi)側(cè)緣切除蝸軸(圖5D)。然后用分離刀沿著基底膜與螺旋韌帶交界處插入，用游絲鑷沿著分離刀的刀刃將螺旋韌帶與基底膜分開(圖5E)。最后用游絲鑷摘除蓋膜(圖5F)并完成耳蝸基底膜鋪片(圖2C)。由于許多藥物造成的耳蝸毛細(xì)胞損害都表現(xiàn)出一個(gè)從耳蝸底回開始逐漸向耳蝸頂回?cái)U(kuò)展的病變模式[18-23],因此選自耳蝸基底膜上某一部位的照片并不能有效表達(dá)整個(gè)耳蝸的病理學(xué)改變特征。我們主張?jiān)诜糯?00倍的光學(xué)顯微鏡下，以目鏡中長度單位為0.24毫米的顯微測(cè)微尺從耳蝸頂回向底回依次測(cè)量基底膜的長度并對(duì)逐個(gè)測(cè)微尺視野內(nèi)的內(nèi)外毛細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)將計(jì)數(shù)結(jié)果輸入到計(jì)算機(jī)與大鼠耳蝸圖軟件中的正常值進(jìn)行比較，從而建立全耳蝸毛細(xì)胞損失百分比的曲線分析圖。我們認(rèn)為只有施行全耳蝸毛細(xì)胞計(jì)數(shù)并用耳蝸圖才能從定位和定量兩個(gè)方面真實(shí)反映全耳蝸各個(gè)不同部位毛細(xì)胞的損害程度[24-27].
采用和不脫鈣取材法相同的解剖分離手法充分暴露前庭各個(gè)終器并分離取下兩個(gè)囊斑及三個(gè)壺腹嵴，最后按類似不脫鈣取材相同的方法修剪前庭終器周圍的膜組織完成鋪片和觀察。許多藥物造成的前庭毛細(xì)胞損害也表現(xiàn)出一個(gè)從囊斑微紋區(qū)向周邊區(qū)擴(kuò)展以及從壺腹嵴頂部向兩側(cè)擴(kuò)展的病變模式[28,29],因此選自某一前庭終器的一張局部放大照片同樣不能有效表達(dá)前庭各個(gè)終器不同部位感覺上皮細(xì)胞的病理學(xué)改變特征。我們主張?jiān)诟弑豆鈱W(xué)顯微鏡下，以框定的一個(gè)小視野做為測(cè)量前庭毛細(xì)胞密度改變的定量觀察指標(biāo)。以球囊斑和橢圓囊斑鋪片為例，以微紋區(qū)幾個(gè)小視野測(cè)量數(shù)據(jù)的平均值來代表該微紋區(qū)的毛細(xì)胞密度，再以周邊區(qū)幾個(gè)小視野的平均毛細(xì)胞密度來反映周邊區(qū)的毛細(xì)胞病變程度。我們認(rèn)為只有用毛細(xì)胞密度的表達(dá)方式才能從定位和定量兩個(gè)方面真實(shí)反映前庭各個(gè)終器不同部位毛細(xì)胞的損害程度[28-30].
3總結(jié)
掌握內(nèi)耳膜迷路取材技術(shù)，是開展內(nèi)耳病理學(xué)研究和組織化學(xué)研究以及分子生物學(xué)研究的必備手段，因?yàn)槿绻〔坏絻?nèi)耳組織材料，上述研究都將無法進(jìn)行。本文介紹了兩種不同的大鼠內(nèi)耳膜迷路取材方法，實(shí)際上無論是不脫鈣取材還是脫鈣后取材，都需要建立在對(duì)大鼠內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)了如指掌的基礎(chǔ)之上，對(duì)內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的了解和熟悉顯然離不開在解剖顯微鏡下的實(shí)際操作練習(xí)。本文在介紹內(nèi)耳膜迷路解剖分離技術(shù)的同時(shí)，著重談到顯微鏡下操作時(shí)每一步驟的具體操作方向、角度、力度及手法，我們希望這些來自實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)能為同道和初學(xué)者提供有益的技術(shù)幫助。本文還討論了如何對(duì)耳蝸和前庭毛細(xì)胞病變進(jìn)行定量分析的合理建議。
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