高通量測序在抗體組學(xué)中的應(yīng)用與展望
抗體是獲得性免疫的主要組分，在防御性及致病性的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用，下面是小編搜集整理的一篇探究高通量測序在抗體組學(xué)應(yīng)用的論文范文，供大家閱讀參考。
前言
抗體是指機(jī)體的獲得性免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞經(jīng)歷產(chǎn)生、成熟、增殖、分化并分泌的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的一類免疫球蛋白[1].抗體是由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈由二硫鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合[2]形成的“Y”形對稱結(jié)構(gòu)的復(fù)合物[3].根據(jù)理化性質(zhì)和生物學(xué)功能不同，抗體分為IgG、IgM、IgA、IgD、IgE五類(表1)。IgG抗體占血清Ig總量的80%,分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四個(gè)亞類，是機(jī)體抗感染的“主力軍”[4-5].IgG在血清中持續(xù)的時(shí)間長，半衰期為20~23d,是唯一能在母親妊娠期穿過胎盤的抗體。IgM占血清Ig總量的5%~10%,是免疫應(yīng)答中最先分泌的抗體，是機(jī)體抗感染的“先頭部隊(duì)”,可用于感染的早期診斷[4-5].IgA抗體占血清Ig總量的10%~15%,分為單體型IgA和分泌型IgA.分泌型IgA主要分布于呼吸、消化、生殖等管道的粘膜表面和乳汁、唾液、淚液中，可中和感染因子，參與局部粘膜免疫，是機(jī)體抗感染的“邊防軍”[4-5].IgD抗體占血清Ig總量的0.2%,主要出現(xiàn)在成熟的B淋巴細(xì)胞表面上，與B細(xì)胞的分化相關(guān)[4].
IgE抗體是血清中含量最少的抗體，約占血清Ig總量的0.003%,主要由粘膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌，參與超敏反應(yīng)，與機(jī)體抗寄生蟲免疫相關(guān)[4-5].
抗體是B淋巴細(xì)胞抗原受體(Bcellantigenreceptor,BCR)的分泌形式，抗體的產(chǎn)生和成熟過程也就是B細(xì)胞的產(chǎn)生、發(fā)育、增殖和分化的過程[2,3,5].其重鏈由V、D、J、C四個(gè)基因片段編碼的，輕鏈由V、J、C三個(gè)基因片段編碼。成熟的B細(xì)胞從骨髓釋放到外周血中，經(jīng)過特異性抗原的刺激后會進(jìn)入淋巴結(jié)的生發(fā)中心，在生發(fā)中心中經(jīng)過細(xì)胞增殖、體細(xì)胞超突變、親和力成熟、抗原受體編輯、種型轉(zhuǎn)化等復(fù)雜事件，分化成能分泌特異性抗體的漿細(xì)胞和少數(shù)的記憶性B細(xì)胞[2,3,5].經(jīng)過生發(fā)中心的.體細(xì)胞超突變和親和力成熟過程，進(jìn)一步增加了抗體譜(Antibodyrepertoire)的多樣性，使抗體的數(shù)量達(dá)到了1013的天文數(shù)字，并提高了抗體對特異性抗原的親和力[2,5].
抗體是獲得性免疫的主要組分，在防御性及致病性的免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵的作用。通過對抗體發(fā)生、發(fā)展和成熟過程的解析，促進(jìn)了對傳染性疾病病理機(jī)制、疫苗設(shè)計(jì)、自免疫疾病治療等免疫學(xué)相關(guān)的研究。例如，通過對HIV-1緩慢進(jìn)展患者體內(nèi)中和廣譜抗體產(chǎn)生及成熟通路的解析，以獲得具有高效中和效應(yīng)的HIV-1特異抗體，并開始應(yīng)用于HIV-1疫苗的研發(fā)[3,6-10].在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自免疫疾病中，自身抗體基因IGHV4-34明顯富集，可以作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎檢測的分子標(biāo)記和免疫治療的靶點(diǎn)[11].通過對抗體發(fā)生、發(fā)展的深入及全面解析，不僅能增加我們對免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識，而且為疾病的治療和疫苗的研發(fā)等臨床應(yīng)用提供新的技術(shù)與方案，引領(lǐng)新型治療性抗體研究的時(shí)代。
低通量測序在抗體研究中的應(yīng)用隨著測序技術(shù)的發(fā)展，抗體組學(xué)的研究經(jīng)歷了從低通量到高通量的時(shí)代變革。在1990~2000年時(shí)，主要利用RT-PCR擴(kuò)增和Sanger測序技術(shù)研究少量B細(xì)胞的抗體特征[12].應(yīng)用這一技術(shù)，人們開展了致病病毒如HIV-1、流感病毒的單克隆抗體和自免疫疾病相關(guān)自身抗體的研究。通過抗體測序結(jié)合克隆表達(dá)，人們獲得了第一代HIV-1的廣譜抗體如b12、4E10、2G12等抗體[13-17],解析了它們的抗原識別位點(diǎn)，為HIV-1疫苗的研發(fā)提供了指導(dǎo)[18-19].運(yùn)用這一技術(shù)，Wardemann等[20]闡明骨髓中產(chǎn)生自身抗體及多效抗體的B細(xì)胞至少經(jīng)過2步獨(dú)立的自體耐受性的檢測，當(dāng)這一過程發(fā)生異常時(shí)會導(dǎo)致產(chǎn)生分泌自身抗體的漿細(xì)胞，誘發(fā)自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[21].
由于技術(shù)的低通量性，每次實(shí)驗(yàn)只能分析幾十到幾百個(gè)B細(xì)胞的抗體特性，與抗體譜的巨大數(shù)據(jù)相比，低通量技術(shù)只為我們揭示了冰山的一角。
高通量測序在抗體組學(xué)中的應(yīng)用對免疫系統(tǒng)的認(rèn)識及對抗體的挖掘及應(yīng)用需要人們能全面深入的了解抗體譜的整體特征，因通量限制，這個(gè)目標(biāo)是傳統(tǒng)技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)的。羅氏454和IlluminaMiseq為代表的下一代測序技術(shù)的應(yīng)用，一次測序即可獲得數(shù)以百萬計(jì)的B細(xì)胞的抗體可變區(qū)域序列。結(jié)合分子標(biāo)記與細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，NGS為人們展示了更廣闊的抗體譜特性，數(shù)據(jù)量更加接近人體抗體譜真實(shí)數(shù)量，使抗體的研究進(jìn)入了大數(shù)據(jù)的時(shí)代。高通量數(shù)據(jù)的捕獲也使得研究抗體家系及抗體的成熟途徑成為現(xiàn)實(shí)。以下將從實(shí)驗(yàn)的操作、測序平臺的選擇、數(shù)據(jù)的分析三個(gè)方面詳細(xì)介紹高通量測序在抗體組學(xué)中的進(jìn)展與應(yīng)用(圖1)。
2009年Weinstein等[22]首次應(yīng)用高通量測序技術(shù)全面研究了斑馬魚的抗體庫特征，揭示不同斑馬魚個(gè)體間重鏈VDJ基因的使用頻率存在相似性，促進(jìn)了高通量測序技術(shù)在人抗體組分析中的應(yīng)用�？贵w的高通量測序需要考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、重鏈與輕鏈配對、數(shù)據(jù)的分析、挖掘及可視化等問題。近5年高通量測序技術(shù)在抗體組學(xué)的應(yīng)用可以分為2個(gè)時(shí)期：第一個(gè)時(shí)期為2009~2013年，利用抗體可變區(qū)與恒定區(qū)的混合引物，通過巢式PCR從外周血單個(gè)核細(xì)胞cDNA中分別擴(kuò)增抗體重鏈與輕鏈基因，然后通過羅氏454測序平臺測序(圖1A)。
應(yīng)用這一技術(shù)從HIV-1患者中分離出了中和力更強(qiáng)的第二代廣譜中和抗體，如VRC01、VRC03、CH103-CH106、CH01-CH04、10E8等。結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究者解析出了HIV-1病毒4個(gè)重要的保守表位結(jié)構(gòu)域，分別是CD4結(jié)合表位、V1/V2區(qū)、V3區(qū)、gp41蛋白近膜外周區(qū)[23-28].對這些抗體成熟通路的解析及HIV-1保守表位的分析，可以指導(dǎo)HIV-1疫苗的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)，從而為預(yù)防HIV-1提供了新的思路。盡管這些方法發(fā)展迅速，但仍存在諸多問題：如混合B細(xì)胞樣本增加了特異性增殖B細(xì)胞克隆分析的難度;設(shè)計(jì)在V區(qū)的正向引物并不能覆蓋所有的抗體基因片段，多個(gè)正向引物的混合增加了PCR的偏好性;盡管可以從混合的mRNA樣本中同時(shí)測出抗體的重鏈與輕鏈，但失去了體內(nèi)重鏈與輕鏈的配對信息;454測序平臺容易引入堿基缺失與插入，增加了后續(xù)分析的難度。
針對以上問題，新的技術(shù)被開發(fā)并成功應(yīng)用到抗體測序中(圖1B-D)。DeKosky等[29]通過物理方法將單個(gè)B細(xì)胞中的重鏈與輕鏈基因連結(jié)在一起，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源重鏈與輕鏈的配對測序(圖1B)。Robinson[30-32]實(shí)驗(yàn)室通過細(xì)胞標(biāo)記的方法，在反轉(zhuǎn)錄過程中對不同的B細(xì)胞cDNA產(chǎn)物5`端引入特異性的標(biāo)記，有利于糾正PCR過程及測序過程中的錯(cuò)誤，并保證了內(nèi)源重鏈與輕鏈的配對(圖1C)。最近Georgiou[33]實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一套新的低花費(fèi)、單細(xì)胞的油滴PCR技術(shù)，既可以保持體內(nèi)重鏈與輕鏈的配對又實(shí)現(xiàn)了高通量，每次實(shí)驗(yàn)可以分析多達(dá)2×106個(gè)B細(xì)胞，提高了測序的廣度與深度度(圖1D)。
5'RACE技術(shù)的應(yīng)用
解決了混合引物擴(kuò)增的偏好性問題，能夠更全面的擴(kuò)增到抗體基因，結(jié)合PGM與IlluminaMiSeq平臺提高了讀段的長度、測序的深度與數(shù)據(jù)量，更利于抗體組的高通量分析[34].因此，單細(xì)胞測序、重鏈與輕鏈配對、5'RACE、PGM與IlluminaMiSeq平臺應(yīng)用，將進(jìn)一步推動抗體組學(xué)在抗體生產(chǎn)、自免疫疾病診斷、疫苗生產(chǎn)及癌癥相關(guān)疾病的研究。
抗體組學(xué)的生物信息分析如何從數(shù)據(jù)的海洋中挖掘出有用的信息，用于指導(dǎo)抗體的生產(chǎn)和疫苗的設(shè)計(jì)，是抗體組學(xué)工作中面臨的巨大挑戰(zhàn)。目前抗體分析中常用的軟件及工具如圖2所示。其中包括的主要步驟如下：對測序得到的原始數(shù)據(jù)(Rawreads)進(jìn)行質(zhì)量控制，濾掉質(zhì)量低與長度短的讀段并獲得干凈的數(shù)據(jù)(Cleanreads);利用IgBlast和IMGT對抗體的可變區(qū)進(jìn)行V(D)J生殖系基因定位(VDJannotation)[35-36];根據(jù)生殖系基因定位將每個(gè)合并的讀段剪切至恰好包含整個(gè)可變區(qū)域;去除冗余數(shù)據(jù)，對于每個(gè)唯一讀段(Uniquereads)記錄其總數(shù)量;系統(tǒng)化注釋獲得reads的可變區(qū)域并提取CDR3區(qū)域;分析CDR3區(qū)域并獲得抗體的家系信息(Cloneorlineage);獲得每個(gè)家系中輕重鏈可變區(qū)域的序列特性，并利用重鏈和輕鏈各家系的reads數(shù)量進(jìn)行輕重鏈配對;對配對好的抗體序列通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能。
利用上述分析軟件與流程，人們開展了大量的抗體相關(guān)工作的分析，促進(jìn)了數(shù)據(jù)的分析與挖掘并加快了免疫學(xué)的進(jìn)展。例如我們課題組最近參與的HIV-1中和抗體的研究，通過連續(xù)15年樣本的大數(shù)據(jù)量的分析，解析了HIV-1廣譜中和抗體VRC01的成熟與變異速率，結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)的分析，揭示了VRC01抗體的進(jìn)化機(jī)制，對開發(fā)HIV-1疫苗具有重大的意義[37].同時(shí)通過對免疫反應(yīng)中抗體譜數(shù)據(jù)特征的分析，揭示了年齡、遺傳等因素對抗體產(chǎn)生與成熟的影響，為開發(fā)相應(yīng)的針對不同人群的有效疫苗提供了指導(dǎo)[38-39].然而，相對于高通量數(shù)據(jù)的快速發(fā)展，目前還沒有一個(gè)統(tǒng)一的分析流程，所有的分析軟件主要是借助了一些免費(fèi)的公用軟件，針對抗體分析的專一性軟件還沒有開發(fā)出來�，F(xiàn)有的分析流程也存在一些問題，如：IgBlast和IMGT對抗體序列進(jìn)行比對時(shí)，不能糾正序列中的錯(cuò)誤，導(dǎo)致比對的不準(zhǔn)確性;由于D基因較短，IgBlast和IMGT不能準(zhǔn)確地定位D基因;抗體成熟過程中AID酶會引入新的突變，增加了抗體的多樣性并提高了抗體的親和力，然而目前的分析不能區(qū)分出AID所介導(dǎo)的突變熱點(diǎn);家系進(jìn)化樹的構(gòu)建完全依賴于序列相似性，沒有考慮原始的生殖基因及AID突變的偏好(Hotspot)，會遺漏掉許多基因并使得進(jìn)化樹不能完全反映細(xì)胞內(nèi)重鏈與輕鏈的配對情況。所有這些問題是需要下一步抗體數(shù)據(jù)分析中得到解決。
展望
從以上對抗體組學(xué)的發(fā)展及應(yīng)用簡述中可以看到，結(jié)合高通量測序的抗體組學(xué)具有效率高、深度大、基因多樣性更豐富、數(shù)據(jù)反映更準(zhǔn)確等優(yōu)勢。最近5年里，高通量測序的抗體組學(xué)分析已經(jīng)成為免疫學(xué)的熱門方法，促進(jìn)了包括抗體發(fā)生、疫苗研發(fā)、腫瘤發(fā)生及自免疫疾病等相關(guān)免疫學(xué)的研究并取得了眾多創(chuàng)新性的成果。但到目前為止，抗體組學(xué)分析的應(yīng)用潛力還遠(yuǎn)未發(fā)揮出來，其技術(shù)仍受到一些現(xiàn)實(shí)條件的約束，如高通量PCR抗體基因擴(kuò)增技術(shù)仍不夠完善、測序讀段長度與準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高、標(biāo)準(zhǔn)的分析流程有待開發(fā)完善。隨著單細(xì)胞分選及測序的應(yīng)用、PCR擴(kuò)增基因方法的改善、細(xì)胞標(biāo)記的應(yīng)用、分析標(biāo)準(zhǔn)的開發(fā)，未來抗體組學(xué)將在診斷、藥理學(xué)、疫苗設(shè)計(jì)及臨床應(yīng)用中發(fā)揮前所未有的重大作用，引領(lǐng)新型治療性抗體研究的時(shí)代。
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