談大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除作用論文

　　大黃是蓼科大黃屬多年生草本植物掌葉大黃(R.pal?matum)、唐古特大黃(R.palmatum var.tanguticum)或藥用大黃(R.officinale)的根和根莖，其主要有效成分為蒽醌類化合物。蒽醌類化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，Ⅱ型豬鏈球菌為一種常見的病原微生物，它在自然界中分布廣泛，可引起人、豬、牛、馬、羊和禽等多種動物感染。在人的感染中，豬鏈球菌常導(dǎo)致化膿性腦炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎和眼內(nèi)炎等疾病，是感染生豬飼養(yǎng)人員和屠宰加工人員的常見細(xì)菌。近年來的研究表明Ⅱ型豬鏈球菌具有形成生物被膜的能力，這會造成疾病感染的持續(xù)性和徹底治愈的困難，因此尋找和研究藥物對生物被膜的消除作用對疾病的治療具有重要的意義。

　　1 材料與方法

　　1.1 儀器與設(shè)備

　　YXQ-LS-50S11 型高壓滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);HZQ-F160 全溫震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);無菌凈化工作臺(蘇州蘇凈集團(tuán)空氣技術(shù)有限公司);S-3400N 掃描電鏡(日本);電子天平(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠Sartorius 公司);酶標(biāo)儀(南京華東電子);超聲震蕩儀(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);96 孔板(海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材制造廠);6 孔板(海門市天龍實(shí)驗(yàn)器材制造廠)。

　　1.2 試劑與材料

　　試劑：THB培養(yǎng)基(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限公司);結(jié)晶紫(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);甲醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);乙醇(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司);磷酸氫二鈉();磷酸二氫鈉()。標(biāo)準(zhǔn)2型豬鏈球菌菌株ATCC700794，購于美國菌種保藏中心;大黃飲片(掌葉大黃(R.palmatum))，購于同仁堂藥店。

　　1.3 方法

　　1.3.1 大黃水提物的制備

　　取大黃100 g ，粉成粗粉，加水1L，浸泡過夜，煎煮1 h，紗布過濾，濾渣加水500 ml 同法煎煮30 min，紗布過濾，合并藥液，濃縮，真空干燥，稱重，研成細(xì)粉，即得。

　　1.3.2 豬鏈球菌生物被膜的培養(yǎng)與觀察

　　取豬鏈球菌菌株ATCC700794 接種于THB 培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)過夜，再用THB培養(yǎng)基稀釋菌液濃度為約1.0×106cfu·mL-1，取100μL加入含有無菌蓋玻片的6孔板，37 培養(yǎng)72 h，取出蓋玻片，滅菌生理鹽水沖洗除浮游菌，戊二醛4固定1 h，0.1mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.2)沖洗兩次后，乙醇脫水，冷凍干燥。樣品表面真空條件下鍍一層厚100～150A的金屬膜，SEM下觀察豬鏈球菌生物被膜形態(tài)。

　　1.3.3 考察不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除作用

　　用96 孔板培養(yǎng)豬鏈球菌生物被膜，并在培養(yǎng)好的96 孔板中分別加入濃度為，31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8 mg/mL和3.9 mg/mL 的大黃水提物，37 培養(yǎng)24 h，無藥組為陰性對照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標(biāo)儀測定OD 值。

　　1.3.4 考察大黃提取物的不同加入時間對豬鏈球菌生物被膜的消除作用

　　用96 孔板培養(yǎng)豬鏈球菌生物被膜，并在培養(yǎng)好的96 孔板中加入濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物，37 培養(yǎng)不同時間6 h、12 h 和24 h，無藥組為陰性對照組。用移液槍棄去96 孔板中的游離菌，滅菌的PBS(pH 7.2)輕輕洗滌三次，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棄去染色液，PBS(pH 7.2)清洗三次，加入33%的冰乙酸溶液，振蕩器10 min，595nm 處酶標(biāo)儀測定OD 值。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 豬鏈球菌生物被膜的形態(tài)觀察

　　使用掃描電鏡法觀察豬鏈球菌菌株ATCC700794 培養(yǎng)72 h 后的生物被膜形成狀態(tài)。觀察到大量細(xì)菌粘附于無菌蓋玻片的表面，且這些細(xì)菌被胞外基質(zhì)如多糖、纖維蛋白、脂蛋白和核酸等物質(zhì)緊密包裹，形成了具有空間結(jié)構(gòu)的團(tuán)塊狀物質(zhì)，而生物被膜是指細(xì)菌被自身所產(chǎn)生的胞外多糖基質(zhì)、脂蛋白、纖維蛋白等所包裹的細(xì)胞形態(tài)的結(jié)構(gòu)群落，因此顯示的細(xì)菌形態(tài)表明豬鏈球菌菌株ATCC700794培養(yǎng)72 h后形成了生物被膜。

　　2.2 不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除影響

　　利用TCP 法考察了濃度為31.2 mg/mL,15.6 mg/mL,7.8mg/mL 和3.9 mg/mL 大黃水提物對對豬鏈球菌生物被膜的消除影響。

　　2.3 大黃提取物的作用時間對豬鏈球菌生物被膜消除的影響

　　利用TCP 法考察了濃度為7.8 mg/mL 的大黃水提物與豬鏈球菌生物被膜的作用時間對豬鏈球菌生物被膜的消除影響。

　　3 討論

　　采用了掃描電鏡法對豬鏈球菌菌株ATCC700794 生物被膜的形成進(jìn)行了形態(tài)學(xué)的觀察，以此判定豬鏈球菌生物被膜形成最佳培養(yǎng)條件，試驗(yàn)中還對培養(yǎng)12 h、24 h 和48 h時生物被膜的形成情況進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)72 小時生物被膜形成最佳。

　　采用TCP法測定不同濃度大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除影響，發(fā)現(xiàn)生物被膜的消除具有劑量依賴性，當(dāng)濃度大于7.8 mg/0mL時大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除作用。同時本研究也對藥物的作用時間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜的消除具有時間依賴性，當(dāng)作用時間大于12 h 時，大黃提取物對豬鏈球菌生物被膜具有良好的消除效果。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為大黃提取物在臨床上的使用提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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