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糖尿病并微血管病變患者血小板CD62p及CD63的表達(dá)及其臨床意義
【摘要】 目的 觀察糖尿病腎病(DN)患者血小板α顆粒膜糖蛋白(CD62p)和溶酶體膜蛋白(CD63)的變化及其臨床意義。方法 采用流式細(xì)胞術(shù)(FCW)檢測(cè)158例糖尿病(DM)患者血漿中CD62p和CD63的陽(yáng)性表達(dá)率，并與45例健康對(duì)照者進(jìn)行比較。結(jié)果 單純性DM組血漿CD62p和CD63的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P＜0?01)，DN微量白蛋白組及大量白蛋白組均顯著高于單純性DM組(均P＜0?01)，DN尿毒癥組顯著低于對(duì)照組(P＜0?01)。結(jié)論 2型糖尿病(T2DM)及DN患者血小板活化均增強(qiáng)，而尿毒癥期血小板活化功能低下，血漿CD62p和CD63的測(cè)定對(duì)DN早期診斷和病情監(jiān)測(cè)有重要的臨床價(jià)值。【關(guān)鍵詞】 糖尿病；微血管病變；血小板膜糖蛋白；流式細(xì)胞術(shù)
糖尿病(DM)與遺傳、自身免疫及環(huán)境等多種因素有關(guān)。糖尿病腎病(DN)是DM的一種嚴(yán)重血管并發(fā)癥，是引發(fā)DM患者死亡的主要原因之一。在疾病的慢性進(jìn)程中，循環(huán)血中處于靜息狀態(tài)的血小板在各種理化和生物因子的作用下，使血小板內(nèi)的顆粒膜糖蛋白和質(zhì)膜糖蛋白迅速發(fā)生數(shù)量重排和構(gòu)型變化而激活成為活化血小板。檢測(cè)活化血小板方法有血小板凝集試驗(yàn)、血小板第4因子(FP4)和β血小板球蛋白(βTG)測(cè)定，但這些方法只能半定量，難以標(biāo)準(zhǔn)化，不能測(cè)定血小板活化量〔1〕。隨著單克隆抗體和流式細(xì)胞儀的應(yīng)用，檢測(cè)血小板表面活化相關(guān)抗原的表達(dá)能夠反映血小板活化，大大提高試驗(yàn)的特異性和敏感性。本文通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)DM患者血漿中CD62p和CD63的陽(yáng)性表達(dá)率，以探討其臨床意義。
1 材料與方法
1?1 對(duì)象
按WHO DM診斷標(biāo)準(zhǔn)〔2〕確診的DM患者158例，其中男80例，女78例，年齡56～81(平均62?21±10?46)歲。所有病例病程穩(wěn)定，無(wú)急性代謝紊亂，無(wú)肝病、腫瘤及風(fēng)濕性疾病，近期無(wú)使用影響腎功能的藥物，未服用雙嘧達(dá)莫、腸溶阿司匹林、復(fù)方丹參等抗血小板藥物。根據(jù)白蛋白排泄率(AER)將其分為①單純性DM組(DM組)：AER ＜20 μg/min，40例，男性18例，女性22例，年齡為59～74(平均64?10±8?33)歲；②DN微量白蛋白組(DNⅠ組)：AER 20～200 μg/min，49例，男性24例，女性25例，年齡為56～79(平均63?76±8?67)歲；③DN大量白蛋白組(DNⅡ組)：AER ＞200 μg/min，43例，男23例，女20例，年齡57～81(平均63?18±10?03)歲；④DN尿毒癥組(尿毒癥組)：其腎功能減退已達(dá)到尿毒癥期，26例，男性15例，女性11例，年齡為63～77(平均66?30±7?41)歲。對(duì)照組：45例，男性21例，女性24例，年齡56～77(平均63?27±9?82)歲，排除DM、高血壓、冠心病、高血脂癥、泌尿系感染、內(nèi)分泌疾病及肝腎疾病的健康體檢者。
1?2 儀器及試劑
EPICS XL型流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman coulter公司生產(chǎn)。流式細(xì)胞儀校正微球(Flow check)由美國(guó)Beckman coulter公司提供(批號(hào)：1683)。熒光標(biāo)記單克隆抗體：藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的McAb(CD62p?PE，批號(hào)：1597；CD63?EP，批號(hào)：1923；免疫陰性對(duì)照MouseIgG1?EP,批號(hào)：1607)均為法國(guó)Immunotech公司產(chǎn)品。
1?3 方法
1?3?1 標(biāo)本準(zhǔn)備
采集靜脈血3 ml，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA?K2)抗凝離心(800 r/min，10 min)，吸上層血漿500 μl于干凈試管中，加入等量的2?5%多聚甲醛500 μl混勻，15 min后加磷酸鹽緩沖液(PBS)2 ml，離心(1 500 r/min,10 min)洗滌3次，然后用PBS將其調(diào)節(jié)成血小板濃度為3×109L-1的血小板懸液。取3支干凈的塑料試管，各管加入血小板懸液100 μl，再分別加入20 μl CD62p、CD63及鼠IgG1，避光反應(yīng)15 min，然后各管加1 ml PBS，混勻待測(cè)。
1?3?2 上機(jī)測(cè)定
流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)前用配機(jī)提供的校正微球進(jìn)行流路和光路的校正，上機(jī)計(jì)數(shù)2×104個(gè)血小板，血小板CD62p及CD63含量以其陽(yáng)性細(xì)胞百分率表示。
1?4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
CD62p、CD63的陽(yáng)性表達(dá)率DM組明顯高于對(duì)照組(P＜0?01)，DN組較DM組明顯增高(P＜0?01)，尿毒癥組則明顯低于對(duì)照組(P＜0?01)，見(jiàn)表1。表1 各組血小板CD62p、CD63結(jié)果比較(略)
3 討論
DM患者由于長(zhǎng)期處于高血糖狀態(tài)，而血糖刺激促使血小板釋放，致使血小板處于激活狀態(tài)，加速了血小板的基本生理功能。同時(shí)，DM隨著病程的進(jìn)展常伴有脂代謝紊亂，高脂血癥也可以使血液黏稠度增加，可誘發(fā)微血管病變〔3〕。部分毛細(xì)血管處于破損或細(xì)小病變中，存在一定程度的血小板聚集和黏附。同時(shí)凝血過(guò)程及受傷和內(nèi)皮組織分泌凝血酶、ATP血小板活化劑，促進(jìn)血小板活化，血小板α顆粒膜糖蛋白140(GMP140)、溶酶體蛋白(GP53)、磷脂酰絲氨酸(PS)暴露于胞漿膜表面，纖維蛋白原受體暴露增加，GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物增加。血小板在活化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到細(xì)胞外，參與止血、凝血、炎癥及組織的修復(fù)過(guò)程，直接或間接作用于血管壁細(xì)胞和(或)其基質(zhì)部分，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致血管內(nèi)斑塊和血栓形成〔4〕。微血栓又可促進(jìn)血小板大量活化，介導(dǎo)白細(xì)胞黏附，T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞聚集；在高血糖環(huán)境下，蛋白激酶C激活，從而出現(xiàn)微
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