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志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)組學(xué)分析
【摘要】 目的 對(duì)志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多株全菌蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較，尋找細(xì)菌耐多藥相關(guān)蛋白。方法 采用4類抗生素的次抑菌濃度，對(duì)臨床分離鑒定的志賀菌敏感株進(jìn)行誘導(dǎo)耐多藥試驗(yàn)；對(duì)志賀菌敏感株及誘導(dǎo)耐多藥株全菌蛋白進(jìn)行雙向電泳；電泳圖譜采用Image Master 2D Platinum軟件分析；差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MOLDI TOF-TOF質(zhì)譜）分析。結(jié)果 成功獲得志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株，在志賀菌敏感株與耐多藥株全菌蛋白質(zhì)圖譜中分別檢測(cè)出（946±37）個(gè)和（1096±189）個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)；共發(fā)現(xiàn)48個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中5個(gè)質(zhì)譜鑒定為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶、天冬氨酸氨甲�；D(zhuǎn)移酶、翻譯延長(zhǎng)因子Tu、單鏈DNA結(jié)合蛋白；其中前3個(gè)蛋白中在耐多藥株中表達(dá)量增強(qiáng)，后2個(gè)減弱。結(jié)論 5個(gè)耐多藥相關(guān)蛋白中在細(xì)胞代謝中起重要作用的酶類表達(dá)量上調(diào)；ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在志賀菌誘導(dǎo)耐多藥機(jī)制中起重要作用。
【關(guān)鍵詞】 志賀菌
近年來，隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，造成志賀菌頻繁發(fā)生變異，產(chǎn)生耐藥株，且耐藥率高、耐藥產(chǎn)生速度快、耐藥范圍廣，給細(xì)菌性痢疾的防治帶來新的挑戰(zhàn)，因此，深入探討志賀菌的耐多藥機(jī)制成為目前解決志賀菌耐多藥的先決條件。本課題選用對(duì)抗生素敏感的1株志賀菌，以自身藥物誘導(dǎo)方式構(gòu)建出多重耐藥菌株，通過比較敏感株與藥物自身誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，觀察與志賀菌耐多藥相關(guān)蛋白，并對(duì)部分表達(dá)差異蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MOLDI TOF-TOF)分析和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,旨在探索其耐多藥機(jī)制。結(jié)果報(bào)告如下。
1 與方法
1?1 材料
1?1?1 菌株 (1)福氏痢疾桿菌標(biāo)準(zhǔn)株：菌株號(hào)51571-9（中國(guó)藥品生物制品檢定所）； (2)敏感株：采用改良K-B紙片法，從臨床分離鑒定的志賀菌株中，篩選1株對(duì)頭孢噻吩(CF）、諾氟沙星（NOR）、慶大霉素（GM）、磺胺甲基異惡唑（SMZ）均敏感的福氏志賀菌作為敏感株。（3）誘導(dǎo)耐多藥株：使用志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株和分離出的敏感株，參考文獻(xiàn)〔1〕的次抑菌濃度(1/2 MIC)誘導(dǎo)耐多藥方法，建立誘導(dǎo)耐多藥株。
1?1?2 試劑與儀器 頭孢噻吩等抗生素均為標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品中心)。固相pH梯度干膠條（immobiline pH gradient pH3～10,L=24cm ）；IPG緩沖液、IPG覆蓋液、兩性電解質(zhì)pharmalyte(pH3～10)、3-［(3-膽酰胺丙基)-乙二胺］-1-丙磺酸(3-［(3-cholamidopropyl)- dimethylammonio］-1-propanesulfonate,CHAPS)(美國(guó)Amersham Pharmacia公司)。丙烯酰胺、尿素（urea）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、蛋白酶抑制劑丙甲基磺酰氟（PMSF）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）(美國(guó)Sigma公司)。固相pH梯度等電聚焦儀IPGphor IEF System ,垂直板電泳儀、ImageScanner光密度掃描儀、圖像分析系統(tǒng)（美國(guó)Amersham Pharmacia公司）。
1?2 方法
1?2?1 蛋白質(zhì)雙向電泳 （1）蛋白提取方法：采用超聲兼Urea-CHAPS-DTT-SB3-10裂解提取法〔2〕,略作改進(jìn)。（2）可溶性總蛋白定量：應(yīng)用BradFord法〔3〕對(duì)提取的可溶性總蛋白進(jìn)行定量；（3）第一相固相pH梯度等電聚焦:按文獻(xiàn)〔4〕,程序分別為30V7h，60V7h，150V0?5h，300V1h，600V1h，8000V12h。（4）平衡：按文獻(xiàn)〔3〕。（5）第二相垂直板SDS-PAGE電泳：按文獻(xiàn)〔3〕。（6）染色：銀染按Amersham Bioscience的銀染方案稍作改進(jìn)〔4〕�？捡R斯亮藍(lán)染色按Neuhoff等的方法進(jìn)行〔5〕。（7）圖像掃描分析：用Amersham Bioscience的掃描儀投射掃描，分辨率為300dpi。數(shù)字化圖像文件運(yùn)用Image Master 2D Platinum軟件分析。圖像分析過程包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)、量化、背景扣除、匹配。蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)自動(dòng)檢測(cè)后進(jìn)行手工校對(duì)，匹配之前先選一塊膠作為參考凝膠，其他凝膠都與之匹配。
1?2?2 質(zhì)譜分析 （1）質(zhì)譜樣品制備：比較雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，切下1mm×1mm×1mm，置于1?5ml的Eppendorf管中,按文獻(xiàn)〔6〕方法處理樣品。(2)質(zhì)譜鑒定:樣品按照1∶1的比例,與含有α-氰基-羥基苯丙烯酸的50%乙腈/0?1%甲酸的溶液混合。所有質(zhì)譜在4700 型MALDI TOF-TOF蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)下獲得。選擇反射式陽(yáng)離子捕獲方式，質(zhì)量精確度為50mg/L;MS光譜質(zhì)量范圍800～4000Da。
1?2?3 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 光譜在全球蛋白服務(wù)工作站（Global Protein Server Workstation，GPS）進(jìn)行處理和分析；搜索在NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行；鑒定GPS可信區(qū)間應(yīng)>95％。搜索參數(shù)設(shè)置：相對(duì)分子質(zhì)量誤差范圍±20%，肽片段相對(duì)分子質(zhì)量誤差范圍±0?5Da，每個(gè)肽允許有1個(gè)不完全裂解位點(diǎn)，物種選擇細(xì)菌；蛋白質(zhì)身份確定：根據(jù)搜索結(jié)果并結(jié)合蛋白質(zhì)在凝膠上的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行最終確定；要求肽段覆蓋率>15%，匹配肽段至少4個(gè)，等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量與觀察值基本相符。
2 結(jié)果
2?1 次抑菌濃度(1/2MIC)誘導(dǎo)耐多藥結(jié)果 志賀菌出發(fā)菌的抑菌濃度（MIC）分別為頭孢噻吩32mg/L，諾氟沙星0?5mg/L，慶大霉素2mg/L，磺胺甲基異惡唑512mg/L。將此出發(fā)菌在1/2MIC的LB培養(yǎng)基中傳代，最終得到MIC≥4倍誘導(dǎo)前的耐多藥菌株，分別是出發(fā)菌株的6，6，8，8倍。
2?2 蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜比較 (1)敏感株：相同實(shí)驗(yàn)條件及參數(shù)設(shè)置情況下,對(duì)志賀菌可溶性總蛋白重復(fù)3次進(jìn)行雙向電泳分離，發(fā)現(xiàn)3次雙向電泳圖譜非常相似，蛋白質(zhì)上樣量為100μg，pH3～10,24cm線性干膠條通過Image Master 2D Platinum分析軟件對(duì)其進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，獲得(946±37)個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(圖1)。(2)誘導(dǎo)耐多藥株：對(duì)志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株可溶性總蛋白重復(fù)3次進(jìn)行雙向電泳分離，獲得3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為1096±189（圖2）。經(jīng)過背景消減后，將其中1塊凝膠作為參考凝膠進(jìn)行匹配，匹配點(diǎn)數(shù)為1078±26，其匹配率為98?36％。
2?3 2種菌株蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜分析 以誘導(dǎo)耐多藥株雙向凝膠圖譜為參考凝膠，與敏感株進(jìn)行匹配，匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)為637±16，匹配率為68?79％，共發(fā)現(xiàn)48個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)(表達(dá)量相差5倍以上的點(diǎn)為差異蛋白質(zhì)點(diǎn))，其中8個(gè)蛋白點(diǎn)只存在于誘導(dǎo)耐多藥株中，8個(gè)蛋白點(diǎn)只存在于敏感株中；在2種菌株中表達(dá)量相差5倍以上的32個(gè)蛋白點(diǎn)中，有26個(gè)蛋白點(diǎn)隨著志賀菌由敏感株向耐多藥株轉(zhuǎn)變而表達(dá)量增加，其余6個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下降（圖3）。蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；
第二向應(yīng)用12?5%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)
圖1 志賀菌敏感株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜 （略）
蛋白質(zhì)上樣量100μg;第一向pH3～10，24cm非線性干膠條；第二向應(yīng)用12?5%聚丙烯酰胺凝膠(銀染)
圖2 志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜（略）
圖3 志賀菌敏感株與誘導(dǎo)耐多藥株的差異表達(dá)蛋白（略）
2?4 質(zhì)譜鑒定（表1） 在考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠上選取5個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行肽指紋圖譜鑒定，結(jié)果可見，200，201，98號(hào)蛋白點(diǎn)表達(dá)量增加，72，14號(hào)表達(dá)量下降。
表1 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果（略）
3 討論
三磷酸腺苷-組合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-Bmding cassettes transparters,ABC)外排系統(tǒng)為細(xì)菌耐多藥主動(dòng)流出機(jī)制之一，腫瘤細(xì)胞膜上此蛋白過量表達(dá)，以便藥物順利進(jìn)入細(xì)胞并很快被泵出，形成多樣抗藥性〔7,8〕。陳川等〔9〕在研究嗜水氣單胞菌耐四環(huán)素的蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在耐藥株中表達(dá)量顯著增加；Bories C等〔10〕在研究利什曼原蟲的藥物作用原理及抗藥性中發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在利什曼原蟲的抗藥性中起重要作用；Sipos G等〔11〕也發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子在真菌的多藥耐受性中起重要作用。本文結(jié)果顯示，98號(hào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transporter protei n) 在志賀菌誘導(dǎo)耐多株中表達(dá)量上調(diào)，表明雖然ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也存在于志賀菌敏感株中，但在志賀菌誘導(dǎo)耐多藥株中表達(dá)量明顯增加，將結(jié)構(gòu)不同藥物泵出胞外，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物達(dá)不到有效濃度而導(dǎo)致細(xì)菌耐多藥，可見此蛋白在志賀菌的耐多藥機(jī)制中也起重要作用。本文結(jié)果還顯示，200號(hào)谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GTP）表達(dá)量增加，提示在長(zhǎng)期低濃度藥物誘導(dǎo)作用下，轉(zhuǎn)肽酶參與的生物代謝反應(yīng)中形成的一些生物介質(zhì)可能在誘導(dǎo)耐多藥過程中起重要作用，從而使此酶的表達(dá)量增加，以滿足細(xì)胞在應(yīng)急條件下生存所必需。從雙向電泳圖譜來看，201號(hào)天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶在誘導(dǎo)耐多藥株中明顯發(fā)生位移，分子量及等電點(diǎn)均增加，表達(dá)量也有所提高，推測(cè)在藥物誘導(dǎo)過程中，該酶可能發(fā)生某些基團(tuán)的修飾作用，以適應(yīng)新而生存。2006年，Tian-Yi Ying等〔12〕對(duì)福氏2a志賀菌2457T的外膜免疫性蛋白質(zhì)進(jìn)行雙向電泳肽指紋圖譜分析及蛋白印跡法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)翻譯延長(zhǎng)因子Tu（Protein chain elongation factor ，EF-Tu）是志賀菌的外膜抗原蛋白。本次結(jié)果表明，14號(hào)EF-Tu在志賀菌的誘導(dǎo)耐多藥株中表達(dá)量降低，可能是其基因調(diào)控序列在長(zhǎng)期藥物誘導(dǎo)過程中發(fā)生變異，使產(chǎn)物的表達(dá)量降低，或可能另一類能調(diào)節(jié)EF-Tu的翻譯延長(zhǎng)因子Ts表達(dá)量降低，從而使EF-Tu活性降低，以適應(yīng)細(xì)胞在不利環(huán)境環(huán)境中生存。72號(hào)單鏈DNA結(jié)合蛋白 (SSB) 在敏感株向耐多藥株轉(zhuǎn)變過程中表達(dá)量也有所下降。本文從全蛋白組角度探討了志賀菌的耐多藥機(jī)制，選擇志賀菌敏感株作為實(shí)驗(yàn)菌株，通過藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生誘導(dǎo)耐多藥株，排除了因菌株不同而導(dǎo)致的差異，可比性好。后續(xù)研究可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多與志賀菌耐多藥的相關(guān)蛋白，從而為志賀菌耐多藥分子機(jī)制及新型抗菌藥物開發(fā)研制提供基礎(chǔ)資料。
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