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動物細胞培養(yǎng)工藝過程監(jiān)測與控制
在細胞培養(yǎng)的過程中，隨著細胞的增殖、底物的消耗及產物的生成，整個培養(yǎng)系統(tǒng)的狀態(tài)一直在產生變化。而各種狀態(tài)變量都有其限制范圍，當超出其界限值時就會對培養(yǎng)過程產生消極的影響，降低培養(yǎng)效率。例如培養(yǎng)基的PH值在培養(yǎng)全過程都應控制在6.8-7.4的范圍內。因此在動物細胞的培養(yǎng)工藝中，利用過程監(jiān)測與控制技術使培養(yǎng)系統(tǒng)保持在最佳的狀態(tài)也是整個工藝中重要的一環(huán)。過程監(jiān)測是指應用各種檢測技術對培養(yǎng)過程中狀態(tài)變量的變化進行追蹤的行為。當這些變量與預測值或與預期變化方式相偏離時，通過過程監(jiān)測的手段便可以及早發(fā)現并開始利用已設定的模型計算如何改變培養(yǎng)狀態(tài)以及時補償這種偏離。而過程控制則利用過程監(jiān)測所提供的信息按照暨定方案進行調整，以使培養(yǎng)過程向更好的方向發(fā)展。由于生物培養(yǎng)過程中許多關鍵變量的值不能夠直接在線測得，因此過程監(jiān)測的基本任務之一就是利用直接測得的變量值去估算間接變量的值，而這也就是狀態(tài)估計的概念。1、在線測量大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)中由于大量細胞的代謝，細胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，在線過程監(jiān)控更為重要。離線取樣測定特別是產物濃度測定往往需要一天的時間，因此這種測定結果，不能用來及時指導生物反應器有關參數的控制和細胞培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)化，而且頻繁取樣容易造成污染，增加費用。因此在線測定生物反應器中培養(yǎng)條件、代謝產物和目的產物濃度等大量數據，并對測定結果進行分析處理，及時對培養(yǎng)系統(tǒng)進行反饋控制是成功進行大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的需要[[i]]。在培養(yǎng)過程中對于過程監(jiān)測與控制具有重要意義同時又可在線測量的參數主要包括：溫度、PH值、pO2、攪拌速率、補料速率、罐壓以及排出氣體中O2和CO2的分壓，等等。因此，在工業(yè)上應用生物反應器進行動物細胞培養(yǎng)時，這些參數都是被在線測量的對象。溫度與PH值這兩個參數對于細胞而言是最基本的影響因素，而在控制時往往與其它參數相獨立。溫度的測量通常在生物反應器內部的單一位置，采用熱敏電阻檢測器（如Pt100熱電阻）進行。PH值則多用復合式玻璃電極測量。Clark復膜氧電極則是溶解氧濃度最常用的檢測元件。所有此類檢測元件都已成為生物反應器的標準配置。攪拌轉速的檢測一般是通過應用磁感應式，光感應式或測速發(fā)電機來實現的。磁感應式和光感應式檢測器是通過計測脈沖數來測量轉速的。安裝在攪拌軸或電機軸上的切片切割磁場或光束而產生脈沖電訊號，則脈沖頻率就反映了攪拌轉速的大小。而測速發(fā)電機是安裝在攪拌軸或電機軸上的小型發(fā)電機，它的輸出電壓和轉速間有良好的線性關系。補料速率直接影響到培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的濃度，它的值多由輸送液體所用泵的單位流量與輸送時間來計算，而泵的單位流量需在培養(yǎng)開始前用補料管道進行實際校準。如果不斷對補料瓶內的剩余體積進行監(jiān)測，則可以得到足夠精確的補料數據來計算其他參數。對于通氣流量測定有多種不同的方法。根據作用原理，流量計可分成兩大類型：體積流量型和質量流量型。體積流量型是根據流體動能的轉換以及流體流動類型的改變而設計的測量裝置。它會引起流體能量的不同程度的損失，而且測量值受到溫度和壓力變化的影響。其主要形式有同心孔板壓差式流量計和轉子流量計。質量流量型是根據流體的固有性質，如質量、導電性、電磁感應性、離子化、熱傳導性能等進行設計的流量計。如利用熱傳導性能對空氣進行測量時沒有能量損失，也不受溫度和壓力的影響。在對尾氣中O2與CO2濃度的測量上可以利用質譜儀進行，但實際生產與實驗中常利用O2的順磁性和CO2的紅外吸收特性進行測定。2、狀態(tài)估計過程變量估計問題大致可以分為兩類：狀態(tài)估計和參數估計，所謂狀態(tài)變量即是指表示系統(tǒng)動態(tài)過程的性態(tài)所需的一組最少數目的變量，它是描述過程內在本質的，不一定是物理上可測的變量；而參數一般即指數學模型方程中待定的未知系數。狀態(tài)和參數的基本區(qū)別在于前者隨時間變化，而后者隨時間保持不變或緩慢變化。對細胞培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)進行分析時，最直接的方法就是通過在線測量獲得數據，再將其代入已有的過程模型中，從而得到關鍵狀態(tài)變量（如細胞密度、代謝速率、產物濃度等）的估計值。細胞在培養(yǎng)過程中，對環(huán)境的微小變化也是極為敏感的，因此狀態(tài)估計所用的模型參數也處于不斷變化之中。故而狀態(tài)估計的問題就在于如何從一個運行中的培養(yǎng)系統(tǒng)內不斷獲得必需狀態(tài)參數的修正值，從而利用在線測得的直接數據正確地分析培養(yǎng)過程所處的狀態(tài)。用于狀態(tài)估計的技術按照其性質及在實踐中的應用可分為許多類型。例如對系統(tǒng)本身及檢測數據時產生的隨機干擾噪聲采用的濾波技術，及針對動態(tài)系統(tǒng)特性發(fā)展出的“推廣卡爾曼濾波”技術；應用非線性動態(tài)系統(tǒng)模型以直接檢測數據推算不能夠直接檢測變量的技術；應用狀態(tài)觀測器以動力學模型推測不能夠直接檢測變量的技術；應用連續(xù)參數估算器不斷調整過程模型中的參數以適應實際觀測數據，從而對狀態(tài)作出估計的技術等。3、過程控制的基本類型控制系統(tǒng)在對培養(yǎng)參數進行調整時可以采用許多模式�？傮w上可分為開環(huán)（open-loop）控制系統(tǒng)與閉環(huán)（close-loop）控制系統(tǒng)。（1）開環(huán)控制系統(tǒng)若系統(tǒng)的控制器與被控對象之間只有順向作用，沒有反向作用，即系統(tǒng)的輸出量對控制作用沒有影響，則稱該系統(tǒng)為開環(huán)控制系統(tǒng)。以細胞培養(yǎng)過程為例，這種控制模式的中心思想是在維持常規(guī)參數（溫度、攪拌、DO、pH等）穩(wěn)定的同時，通過已建立的數學模型預測某一時間點細胞的生長代謝狀態(tài)，估算氨基酸代謝通路和流量以及ATP的消耗，并以此作為培養(yǎng)基補加策略及成分調整的依據，在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之前作出調整。在這方面，關于雜交瘤生長和單抗生成的多種數學模型已經建立[[ii],[iii]]。系統(tǒng)化、結構化的補料策略也有了相當的發(fā)展[[iv],[v]]。但由于這種模式要求對細胞生長和代謝的每一個細節(jié)都很清楚，在目前對生物體復雜的內在機理認識不足的情況下，理論預測與培養(yǎng)實踐仍有很大差距，這使得理論模型應用于實際生產受到了很大限制。（2）閉環(huán)控制系統(tǒng)系統(tǒng)的輸出量或狀態(tài)變量對控制作用有直接影響的系統(tǒng)稱為閉環(huán)控制系統(tǒng)。閉環(huán)模式相對于開環(huán)模式主要的區(qū)別是不需要建立模型去預測細胞和微環(huán)境將來的變化,而是通過在線(on-line)和/或離線(off-line)檢測手段獲得狀態(tài)數據，由人工或控制軟件根據當前值的變化即時調整培養(yǎng)設定參數，使培養(yǎng)系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)。這種模式是在細胞狀態(tài)發(fā)生改變之后作出調整，也稱為反饋控制模式。細胞培養(yǎng)過程中溫度、PH及溶解氧濃度等基本變量的控制都是采用閉環(huán)模式進行的。同時由于控制的目的是減小實測值與設定值間的差距，因此屬于負反饋控制。針對動物細胞培養(yǎng)，當前研究的方向有：利用攝氧速率（OUR）與底物消耗速率、副產物生成速率等參數綜合估算的結果來反饋調整營養(yǎng)物的流加及培養(yǎng)基的灌流[[vi],[vii],[viii],[ix],[x]]；利用葡萄糖、谷氨酰胺等物質的消耗速率及預先設定的濃度變化點來反饋調整營養(yǎng)物流加速率[[xi]]；利用培養(yǎng)過程中各種相關物質濃度間的比值設計出“軟探針”，并以此反饋控制培養(yǎng)過程[[xii]]。（3）PID(proportional integral derivative)控制模型在培養(yǎng)實踐中，一些狀態(tài)變量如溫度，只需要控制在37℃或其他固定的點上就可以滿足要求，則其控制采用“三點控制模式”即可。具體控制過程是首先以設定點為基準設置上、下限，當溫度高于/低于設定上限時啟動/關閉冷卻系統(tǒng)，當溫度低于/高于設定下限時啟動/關閉加熱系統(tǒng)，如此使溫度保持恒定。但在對更多的狀態(tài)變量（如PH，補料速率）進行閉環(huán)控制時采用這種簡單的方法會導致狀態(tài)變量不斷地圍繞設定值波動，對細胞的生長與代謝產生不良影響。在利用閉環(huán)模式對培養(yǎng)系統(tǒng)進行控制時，為有效而穩(wěn)定地減小實測值與設定值間的偏差而免去人為的干預，自動控制理論中一種狀態(tài)校正模式—PID(proportional integral derivative)控制模式便得到了廣泛的應用。它的微分方程表達式為式中u(t)為輸出值或設定值，e(t)為輸入值或實測值與設定值間的偏差，而式中的設計參數分別為比例增益KP、積分增益KI和微分增益KD。利用這種控制模式可以使系統(tǒng)在受干擾而發(fā)生波動時盡快進入穩(wěn)定狀態(tài)，使細胞所受影響減到最低。具體的控制過程如圖所示，狀態(tài)變量在PID模式控制下隨時間進行而趨于穩(wěn)定：
| 設定值 |
[i]林福玉，陳紹烈，劉紅，等.大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)的問題及對策.生物技術通報，1999，7(1):32-35[ii] Nielsen L.K.,et al.Avoiding rapid growth at high cell densities:a potentially important optimisation criterion for hybridoma cultures.Cytotechnology,1992,9:21-34.[iii]胡顯文，李佐虎，陳建新，等.氣液雙升式反應器動物細胞培養(yǎng)及批式生長動力學模型.生物技術通訊，1999,10(2):104-108.[iv] C.S. Sanderson,et al.A structured, dynamic model for animal cell culture systems. Biochemical Engineering Journal,1999,3:203-211.[v] Christoph Herwig,et al.On-line stoichiometry and identification of metabolic state under dynamic process conditions.Biotech
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