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絲素蛋白作為基因傳遞載體的研究
非病毒基因傳遞載體的生物安全性隱患小、免疫原性低、操作簡單，近年來得到廣泛研究，下面是小編搜集的一篇相關論文范文，歡迎閱讀參考。
基因治療是將用于治療的外源性基因運送到靶細胞內(nèi)，使其適當表達，達到治療疾病的目的[1].基因治療的關鍵之一是選擇合適的傳遞和表達載體。
理想的基因傳遞載體應具有良好生物相容性和生物可降解性，無細胞毒性、無免疫源性;能包裝并壓縮DNA形成較小的載體/DNA復合物;能保護DNA不被降解;能高效地將外源性DNA傳遞到靶細胞內(nèi)，使目的基因從內(nèi)涵體逃逸并得到穩(wěn)定的表達。
基因傳遞載體分為病毒載體和非病毒載體兩大類[2].
1、用于基因傳遞的病毒載體
病毒的基因組比較簡單，易于改造，是一類高效的基因傳遞載體。用作基因傳遞載體的病毒有逆轉錄病毒、腺病毒相關病毒和腺病毒等。
逆轉錄病毒在病毒載體中應用最早。用逆轉錄病毒包裝基因后感染細胞的技術已被廣泛研究試圖用于骨修復、軟骨修復、傷口愈合和組織工程血管領域。包裝骨形成蛋白-2基因的逆轉錄病毒轉染骨髓基質(zhì)細胞后，將細胞種植在支架內(nèi)移植到大鼠的骨缺損部位，在體內(nèi)可以誘導骨的形成[3-4].用攜帶血管衍生生長因子(PDGF-B)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF121)基因的逆轉錄病毒感染種植在聚乙醇酸的支架上的真皮成纖維細胞，植入動物的皮膚缺損創(chuàng)面的結果表明，可以加快傷口的愈合速度[5].但逆轉錄病毒有可能被整合到靶細胞的基因組，表達其所攜帶的外源性基因，這存在基因突變致癌的潛在風險。
腺病毒相關病毒(AAV)是一種無包膜的單鏈DNA缺陷型病毒。在再生醫(yī)學領域，有將AAV用作組織工程相關的基因的傳遞載體的報道。將AAV/血管內(nèi)皮細胞生長因子基因復合物用于治療小鼠深度燒傷創(chuàng)面[6]、大鼠全層皮缺損創(chuàng)面[7]和糖尿病小鼠的皮膚傷口[8]的研究表明，AAV/血管內(nèi)皮細胞生長因子基因復合物可以促進創(chuàng)面的血管化和細胞外基質(zhì)的成熟，加快傷口的愈合。
腺病毒是雙鏈DNA病毒，具有宿主范圍廣、攜帶外源性基因的容量大等優(yōu)點。導入的基因在宿主細胞內(nèi)是以游離的形式存在，不會整合到宿主細胞的基因組中[9].腺病毒作為基因傳遞載體在組織工程領域也被廣泛研究。將攜帶VEGF基因的腺病毒直接混合到移植顆粒脂肪內(nèi)注射到體內(nèi)后，可以促進血管的形成，提高移植脂肪的成活率[10].但病毒類基因載體仍存在免疫原性等潛在風險，所以構建生物安全性高、生物相容性好、轉染效率高和靶向特異性強的新型基因傳遞載體是基因治療領域的重要課題。
2、用于基因傳遞的非病毒載體
非病毒基因傳遞載體的生物安全性隱患小、免疫原性低、操作簡單，近年來得到廣泛研究。陽離子脂質(zhì)體是最常見的非病毒基因傳遞載體，聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)、殼聚糖、明膠等聚合物作為非病毒基因傳遞載體也備受關注。
帶正電荷的陽離子脂質(zhì)體[11]與帶負電荷的質(zhì)粒DNA能夠通過靜電相互作用結合，形成脂質(zhì)體/DNA復合物。陽離子脂質(zhì)體表面的過剩正電荷為脂質(zhì)體/DNA復合物被帶負電荷的細胞膜吸附提供條件。脂質(zhì)體本身具有的親脂性，使脂質(zhì)體/DNA復合物能夠通過細胞的內(nèi)吞作用或者細胞膜的融合作用進入細胞，復合物在細胞質(zhì)或者細胞核內(nèi)釋放DNA,實現(xiàn)基因的轉錄、翻譯和表達[12].陽離子脂質(zhì)體通常由陽離子脂質(zhì)和中性輔助磷脂兩部分組成。其中，陽離子脂質(zhì)可以通過靜電引力與帶負電荷的DNA質(zhì)粒結合，包被DNA質(zhì)粒形成復合物;而中性輔助磷脂則可降低陽離子脂質(zhì)的細胞毒性，并增強陽離子脂質(zhì)的細胞滲透能力，提高陽離子脂質(zhì)體的基因轉染效率[13-14].Jeschke等[15]用陽離子脂質(zhì)體作為胰島素樣的生長因子(IGF-Ⅰ)基因的傳遞載體，用于大鼠的燒傷創(chuàng)面治療，結果表明大鼠血清和肝臟中的生長因子蛋白濃度有所提高，創(chuàng)面愈合顯著加快。在陽離子脂質(zhì)體中引入膽固醇或其衍生物后，可以提高脂質(zhì)體/DNA復合物對靶細胞的基因轉染效率。例如，在陽離子脂質(zhì)體中嵌入膽固醇后，由于膽固醇具有親脂性，可以使陽離子脂質(zhì)體/DNA復合物更順利地通過質(zhì)膜，提高復合物的細胞滲透功能，并穩(wěn)定脂質(zhì)雙層膜、減輕陽離子成分對細胞的毒性[16-17].
Shigeta等[18]合成的具有較寬pH緩沖能力的膽固醇衍生物與陽離子脂質(zhì)體共同包被質(zhì)粒DNA,轉染肝細胞的結果表明，該復合物具有類似聚乙烯亞胺作為基因傳遞載體時的質(zhì)子海綿效應，能夠加速復合物從溶酶體釋放，使外源性質(zhì)粒DNA有效被釋放到靶細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，明顯提高基因轉染效率。
除陽離子脂質(zhì)體外，近年將聚賴氨酸(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)等合成的陽離子聚合物以及殼聚糖、明膠等天然聚合物用作基因傳遞載體的研究也很活躍。
Laemmli等[19]在1975年證明PLL有壓縮DNA質(zhì)粒的能力，體外和體內(nèi)實驗都表明其可用于基因傳遞載體[20-21].伯胺基的數(shù)量影響PLL壓縮DNA質(zhì)粒形成復合物的能力，只有當PLL的分子量大于3kDa時，才能有效地壓縮質(zhì)粒DNA形成穩(wěn)定的復合物[22],而高分子量的PLL存在相對較大的細胞毒性。用聚乙二醇修飾PLL后，可以提高PLL/DNA復合物的穩(wěn)定性，同時降低對細胞的毒性[23].
聚乙烯亞胺(PEI)是目前研究最廣泛的陽離子聚合物基因載體，也是基因傳遞能力最強的合成聚合物，被認為是合成高分子基因傳遞載體的金標準[24].它有線性和支化兩種結構形式。支化PEI作為基因傳遞載體時的最重要特性是具有質(zhì)子海綿效應，基因轉染效率較高。
PEI/DNA復合物進入細胞后，在吞噬泡的酸性環(huán)境中質(zhì)子化，正電荷增多，使溶酶體破裂，復合物可被有效釋放，這為后續(xù)的基因轉錄和表達提供了良好基礎[25-26].高分子量的PEI雖然轉染效率較高，但因帶有高密度的正電荷，且不易被降解，在細胞內(nèi)的積累影響細胞的功能，細胞毒性較大。通過對高分子量PEI進行化學修飾可以降低其細胞毒性[27],例如用聚乙二醇修飾PEI后，不僅可降低PEI的細胞毒性、明顯提高細胞的存活率，而且可提高PEI/DNA復合物的穩(wěn)定性，與未經(jīng)修飾的PEI相比，體外的細胞轉染效率提高約三倍[28].
殼聚糖是天然的陽離子高分子，具有細胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等優(yōu)點。將其用作基因傳遞載體的研究表明，它可以有效地壓縮DNA并保護其不被核酸酶降解[29-30].殼聚糖的脫乙酰度、分子量以及DNA濃度、pH值等影響殼聚糖與DNA形成的復合物的性能和基因轉染效率[31-32].
殼聚糖也存在與其他非病毒基因傳遞載體相似的兩大不足，即細胞轉染效率較低和細胞靶向性弱。明膠也具有細胞毒性低、可被生物降解、免疫原性低等優(yōu)點。已被證明可以作為基因傳遞載體[33].
Hosseinkhani等[34]制備陽離子化明膠/骨形成蛋白基因納米復合物，將復合物裝載于膠原海綿支架內(nèi)體外轉染骨髓間充質(zhì)干細胞，實驗表明，陽離子化明膠能夠使其攜帶的骨形成蛋白基因轉染骨髓間充質(zhì)干細胞，并使目的基因表達、促進骨的形成。
無論是合成高分子還是天然高分子，用作基因傳遞載體時需要進一步解決的問題是如何使其兼具良好的生物降解性、低毒性、高靶向性和高轉染效率。
3、絲素蛋白作為基因傳遞載體的研究
絲素蛋白具有良好的生物相容性，可被生物降解[35],對生物體無毒性、無刺激性、無明顯的免疫原性，且絲素的降解產(chǎn)物對生物體無毒副作用[36-37],被154現(xiàn)代絲綢科學與技術2015年(第30卷)第4期廣泛地用于細胞培養(yǎng)載體和組織工程支架。經(jīng)基因工程方法改性的絲蛋白具有新的性能。將蜘蛛絲蛋白的基因與聚賴氨酸基因片段重組后，可得到含聚賴氨酸序列的重組蜘蛛絲蛋白[38].該重組蜘蛛絲蛋白的表面帶更多的正電荷，有助于包被、壓縮DNA,形成重組蜘蛛絲蛋白/DNA納米級的復合物。含有30個賴氨酸殘基的重組絲蛋白與DNA復合后轉染HEK細胞時的轉染效率約為14%,而不含聚賴氨酸序列的絲蛋白的轉染效率僅為約0.4%.
柞蠶絲素蛋白是最常見的一種野蠶絲素蛋白，其氨基酸序列中含有的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(RGD)三肽序列能與哺乳動物細胞表面黏附家族中的整合素特異性結合，有利于其用作基因傳遞載體時被細胞粘附、吞噬[39].Ma等[40]利用帶負電荷的柞蠶絲素蛋白的良好細胞相容性和可降解性，能夠屏蔽PEI多余的正電荷、減小細胞毒性，表面存在細胞特異性粘附序列，可以與血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等細胞表面的受體發(fā)生特異性相互作用等特點，用柞蠶絲素蛋白和PEI(25kDa)共同作為VEGF165和Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒的傳遞載體，研究了與PEI單獨作為傳遞載體相比，載體的形態(tài)、結構、理化性質(zhì)的變化，及其對細胞毒性、轉染效率的影響。柞蠶絲素蛋白的導入，能夠提高PEI/DNA復合物的細胞親和性，更好地避免其被核酸酶降解。用柞蠶絲素/PEI/DNA復合物體外轉染小鼠成纖維細胞L929的結果表明，與單純使用PEI相比，能有效降低細胞毒性、提高轉染效率并使目的基因表達。依靠靜電相互作用，用柞蠶絲素蛋白與PEI聯(lián)合包被質(zhì)粒DNA后轉染HEK293和HCT116細胞時，同樣能顯著降低PEI/DNA復合物的細胞毒性，更高效地使外源性基因轉染HEK293和HCT116細胞[41].
由于未經(jīng)改性的絲素蛋白在生理條件下帶有負電荷，與帶負電荷的質(zhì)粒DNA之間存在靜電斥力，難以包裹、壓縮DNA.化學改性是調(diào)節(jié)絲素的性能以適應不同應用需求的重要手段。絲素蛋白含有一定量的帶極性側鏈的氨基酸殘基，能夠作為化學修飾的潛在反應位點，這為絲素蛋白的化學改性及其用作基因傳遞載體提供了物質(zhì)基礎[42-43].扈永培等[44]利用陽離子多胺類物質(zhì)精胺對柞蠶絲素蛋白進行化學修飾，使改性后的柞蠶絲素蛋白在生理環(huán)境下帶正電荷，得到陽離子化的柞蠶絲素蛋白，用陽離子化柞蠶絲素包被VEGF165-Ang-1雙基因共表達質(zhì)粒體外轉染小鼠成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞，能明顯提高細胞的轉染效率和降低對細胞的毒性，為皮膚真皮等含血管組織的微血管網(wǎng)絡再生和缺損組織的修復提供了一種新的基因傳遞載體。
Numa-ta等[45]利用基因工程的方法在家蠶絲素鏈上插入L-賴氨酸和RGD序列，構建新型絲素蛋白用作基因載體。研究結果表明，當該新型絲素-賴氨酸-RGD聚合物與DNA的N/P比大于2/1時，能夠有效包裝、壓縮DNA.轉染人宮頸癌細胞(Hela)和人胚腎成纖維細胞(HEK)的結果表明，該新型絲素蛋白用作基因傳遞載體時，能夠有效地被細胞粘附，尤其能夠被細胞膜表明存在大量RGD受體的Hela細胞粘附，能夠有效地使其攜帶的目的基因轉染靶細胞。
4、結語
絲素蛋白經(jīng)生物、化學或物理方法改性后得到的陽離子化絲素蛋白具備作為基因傳遞載體的基本條件。通過對絲素蛋白的修飾、改性技術及其介導基因轉染機制的深入研究，有可能為生物醫(yī)學領域提供一類高效、低毒性的新型基因傳遞載體。
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