生物質(zhì)炭鈍化修復(fù)Cd污染土壤的微生物機(jī)制論文
我國(guó)農(nóng)田土壤重金屬鎘污染形勢(shì)嚴(yán)峻。研究報(bào)道，目前我國(guó)已有超過(guò)13萬(wàn)km2的耕地被Cd污染，包含11個(gè)省市，25個(gè)地區(qū)[1],污染范圍廣、規(guī)模大，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)安全構(gòu)成巨大的威脅。據(jù)近期調(diào)查顯示，土壤Cd污染物含量呈現(xiàn)從西北到東南，從東北到西南逐漸升高的地理分布態(tài)勢(shì)，且西南地區(qū)重金屬超標(biāo)范圍較廣[2].顯然，重金屬Cd污染使南方紅壤生態(tài)系統(tǒng)已具風(fēng)險(xiǎn)性，治理Cd污染紅壤迫在眉睫。生物、物理及化學(xué)多種常規(guī)方法被應(yīng)用到污染土壤修復(fù)中。國(guó)外研究報(bào)道生物質(zhì)炭施用到Cd污染土壤，Cd的生物有效性大幅降低，Cd濃度下降到原來(lái)的10%[3].本課題組前期研究也顯示生物質(zhì)炭輸入到土壤后，Cd有效態(tài)下降，殘?jiān)鼞B(tài)上升，水稻生物有效性降低[4].說(shuō)明，生物質(zhì)炭是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的化學(xué)鈍化修復(fù)劑，但修復(fù)機(jī)制尚未有統(tǒng)一明確的說(shuō)法。已有研究顯示，生物質(zhì)炭緩解重金屬的負(fù)面環(huán)境效應(yīng)受自身孔隙度、比表面積、含氧官能團(tuán)等特性的影響，還和生物質(zhì)炭改善土壤p H值、有機(jī)質(zhì)含量等因素有關(guān)，此外也受制于生物質(zhì)炭類(lèi)型、添加量等因子[5-6].
微生物是土壤生命力不可或缺的部分，是土壤肥力、質(zhì)量、健康的敏感性衡量指標(biāo)之一它對(duì)重金屬污染反應(yīng)靈敏，當(dāng)重金量超過(guò)臨界值時(shí)微生物量、活性[7]、種群結(jié)構(gòu)及多樣性[8]受到脅迫降低。然而，某些種群微生物在重金屬污染土壤中依然能長(zhǎng)期生存，可見(jiàn)微生物憑借吸收、富集、溶解和沉淀手段反作用于重金屬。檸檬酸細(xì)菌就能固定土壤中的Cd2+[9].生物質(zhì)炭可提高土壤微生物的豐度、活性、改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)和組分。已有研究證實(shí)了2種生物質(zhì)炭添加到土壤后均可以增加各類(lèi)菌群的含量，改變土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)[10].也有研究表明，生物質(zhì)炭添加前后，土壤中固氮菌的群落結(jié)構(gòu)差異顯著[11].團(tuán)聚體是土壤基本結(jié)構(gòu)單元和組成部分。重金屬Cd、微生物2者在不同粒級(jí)的土壤團(tuán)聚體中表現(xiàn)出不同的空間行為。很早便有研究表明，大團(tuán)聚體中細(xì)菌生物量明顯比真菌低，并且大團(tuán)聚體數(shù)量束縛著真菌生物量，與小團(tuán)聚體相比，大團(tuán)聚體的微生物量多[12].生物質(zhì)炭-土壤-微生物3者之間交互影響關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，目前關(guān)于生物質(zhì)炭鈍化重金屬Cd的機(jī)理仍停滯在生物質(zhì)炭本身和土壤理化性質(zhì)2個(gè)方向，微生物這一因素卻鮮有研究�；谝陨媳尘�，本文選取外加Cd處理過(guò)的紅壤進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對(duì)生物質(zhì)炭輸入后土壤團(tuán)聚體中微生物種群在碳源代謝功能多樣性方面上的響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究，試圖從團(tuán)聚體角度揭示生物質(zhì)炭鈍化修復(fù)Cd污染土壤的微生物機(jī)制，以期為南方紅壤土重金屬污染防治及紅壤生態(tài)系統(tǒng)安全保障提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 供試土壤本實(shí)驗(yàn)的供試土壤為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山的山原紅壤，為云南典型紅壤，是可種植水稻的非水稻土，因重金屬含量接近本底值，對(duì)其進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)易探究Cd這一因素對(duì)紅壤微生物區(qū)系的作用及生物質(zhì)炭的恢復(fù)機(jī)制。p H值為5.35,電導(dǎo)率為420?s/cm,含有機(jī)質(zhì)44.26g/kg,有效磷64.55mg/kg,堿解氮99.05mg/kg.
1.1.2 生物質(zhì)炭本研究選取是河南三利公司生產(chǎn)的小麥商品秸稈生物質(zhì)炭。 p H值為9.03,有機(jī)碳543.7g/kg,全氮1.98g/kg,全磷3.2g/kg,全鉀28.65g/kg,比表面積23.26m2/g,陽(yáng)離子交換量185.56mol/kg.
1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
實(shí)驗(yàn)為盆栽模擬實(shí)驗(yàn)，選用普通塑料桶，每桶裝8kg土。配制Cd Cl2母液，與土壤反復(fù)混合均勻。秸稈生物質(zhì)炭按照0%、2.5%、10%的質(zhì)量比添加到上述混勻土壤中（因在前期項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)中5%生物質(zhì)炭添加量下Cd形態(tài)、土壤酶活性沒(méi)有明顯變化，所以本實(shí)驗(yàn)沒(méi)按照梯度設(shè)置生物質(zhì)炭添加量，選取了變化顯著的2.5%、10%生物質(zhì)炭添加量）并設(shè)置無(wú)任何添加的空白對(duì)照組，既得到4種不同的處理：Cd添加量為0mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為0%（簡(jiǎn)稱(chēng)為CK）；Cd添加量為2.5mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為0%（簡(jiǎn)稱(chēng)為B0）；Cd添加量為2.5mg/kg,生 物 質(zhì) 炭 添 加 量 為2.5%（簡(jiǎn) 稱(chēng) 為B2.5）；Cd添加量為2.5mg/kg,生物質(zhì)炭添加量為10%（簡(jiǎn)稱(chēng)為B10）。每種處理設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照組，置于溫室大棚中并種植水稻，調(diào)節(jié)并保持土壤濕度至田間持水量的70%,待水稻成長(zhǎng)到分蘗期時(shí)采集（5點(diǎn)法）各處理土壤進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
1.3 土壤團(tuán)聚體的分離方法
采用Elliott[13]的濕篩法分離不同粒徑的團(tuán)聚體。把清除石子和水稻根系的土壤放入孔徑為5、2、1、0.5、0.25mm的套篩中。套篩中倒入滅菌水，使水剛沒(méi)過(guò)最上層篩子，然后勻速上下移動(dòng)套篩15min,便得到>5mm、5~2mm、2~1mm、1~0.5mm、0.5~0.25mm、<0.25mm 6種不同粒徑團(tuán)聚體。其中以0.25mm粒徑為界限分類(lèi)，大于它的為大團(tuán)聚體，小于它的為微團(tuán)聚體。
1.4 土壤微生物群落功能多樣性測(cè)定方法
本研究采用Biolog-ECO板分析土壤微生物群落的代謝功能特征。ECO板接種液的制備采用Classen等[14]的方法。稱(chēng)取相當(dāng)于5g烘干質(zhì)量的新鮮土樣置于無(wú)菌三角瓶，加入45m L濃度為0.85%的無(wú)菌生理鹽水，200r/min振蕩30min后靜置15min,取5m L上清液至裝有45m L無(wú)菌生理鹽水的三角瓶中，重復(fù)稀釋3次，制得1:1000的接種液。將ECO板提前預(yù)熱到25℃，用八道移液搶取150?L接種液于每孔中。ECO板置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃左右避光培養(yǎng)7d,分別于4、24、48、96、120、144、168h用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)讀取590nm處吸光值，每板重復(fù)讀數(shù)3次。
1.5 數(shù)據(jù)處理
本文中土壤微生物整體活性用微平板每孔顏色平均變化率（AWCD）描述。土壤微生物群落功能多樣性用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)與Mc Intosh指數(shù)表征。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析和主成分分析均用SPSS（19）軟件完成，Excel（2007）繪圖。具體數(shù)據(jù)處理公式詳見(jiàn)于表1.
2 結(jié)果與分析
2.1 不同處理下土壤團(tuán)聚體微生物群落活性的變化
AWCD是溫育時(shí)間內(nèi)Biolog每板的平均顏色變化率，能夠反映土壤微生物的活性、生理功能多樣性，它在時(shí)間維度上的變化可表征微生物的平均活性[15].如圖1所示，不同處理不同粒徑團(tuán)聚體土壤微生物AWCD值均隨著溫育時(shí)間延長(zhǎng)而增加，表明不同處理下各粒徑團(tuán)聚體中土壤微生物碳源利用能力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。從時(shí)間維度上看，不同處理下各團(tuán)聚體AWCD值4h之前接近0,碳源幾乎未被利用；4~24h之間增長(zhǎng)緩慢，碳源利用率低；24~120h時(shí)間段內(nèi)快速增長(zhǎng)變化明顯，碳源被大幅度利用；120h增長(zhǎng)趨于平緩，碳源利用能力逐漸減弱。土壤微生物的整體代謝活性與AWCD值的增長(zhǎng)速率呈極顯著的正比例關(guān)系，24~120h時(shí)間段內(nèi)，碳源利用率強(qiáng)，微生物活性最強(qiáng)。各粒徑團(tuán)聚體中4種處理的碳源利用率均呈B2.5>B10>CK>B0的規(guī)律，重金屬Cd污染致使土壤微生物碳源利用單一、利用能力弱，微生物代謝活性降低，施入生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組碳源利用能力增強(qiáng)，微生物代謝活性得到提升并高于了CK空白對(duì)照組，尤其是B2.5處理組生物質(zhì)炭對(duì)土壤微生物活性影響顯著。不同處理下6種大小不同粒徑的團(tuán)聚體碳源利用能力從強(qiáng)到弱依次為：>5mm（10.55）團(tuán)聚體、2~1mm（10.42）團(tuán)聚體、<0.25mm（10.18）團(tuán)聚體、5~2mm團(tuán)聚體（8.50）、1~0.5mm（6.26）團(tuán)聚體、0.5~0.25mm（5.00）。5~1mm大團(tuán)聚體與<0.25mm的微團(tuán)聚體中土壤微生物碳源代謝活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1~0.25mm團(tuán)聚體，特別是在>5mm、2~1mm 2個(gè)粒徑團(tuán)聚中碳源代謝活性達(dá)到峰值。<0.25mm的微團(tuán)聚體中B0處理組AWCD值增長(zhǎng)最緩慢，與其余3個(gè)處理組相比微生物代謝活性差異明顯。
2.2 不同處理下土壤團(tuán)聚體微生物多樣性指數(shù)的變化
Shannon多樣性指數(shù)是研究群落物種豐富度的綜合指標(biāo)，Simpson指數(shù)較多反映了群落中最常見(jiàn)的物種優(yōu)勢(shì)度，Mc Intosh指數(shù)則是群落中物種均一性的度量[16]文中利用3種多樣性指數(shù)，在各土壤團(tuán)聚體中培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)AWCD值較穩(wěn)定的120h的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上分析土壤微生物群落功能多樣性。由表2可知，首先，各粒徑團(tuán)聚體中微生物的Shannon、Simpson、Mc Intosh 3種多樣性指數(shù)值4種處理均呈現(xiàn)B2.5>B10>CK>B0的規(guī)律。方差分析也顯示，添加生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組與單加Cd對(duì)照處理組之間差異顯著，表明重金屬Cd毒害作用迫使土壤微生物豐度降低，群落常見(jiàn)物種受到限制，物種均一性遭到破壞，而生物質(zhì)炭的施 入 對(duì)微生物 的 多樣性具 有 提升作用，B2.5處理組的'作用效果尤為顯著。其次，各處理下3種多樣性指數(shù)值均在5~1mm、<0.25mm粒>5mm、5~2mm、2~1mm、1~0.5mm、0.5~0.25mm、<0.25mm 6種不同粒徑團(tuán)聚體中，添加生物質(zhì)炭的2個(gè)處理組與單加Cd的B0對(duì)照組相比，Shannon指 數(shù) 分 別 上 升 了24.62%, 34.30%,58.41%,52.88%,46.76%,131.25%;Simpson指數(shù)分別上升了24.44%,20.00%,36.11%,39.68%,44.07%,73.73%;Mc Intosh指 數(shù) 分 別 上 升 了32.68%,35.74%,86.36%,87.15%,84.73%,135.52%.由此可得出，生物質(zhì)炭對(duì)Cd污染土壤中微生物多樣性的提升作用隨著團(tuán)聚體的粒徑的減小呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，<0.25mm微團(tuán)聚體中提升作用最為突出；從整體角度出發(fā)，它使Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度發(fā)生了顯著變化，群落物種的豐富度也得到一定的提升，但生物質(zhì)炭對(duì)群落中常見(jiàn)的微生物物種影響甚微。
2.3 不同處理下土壤團(tuán)聚體微生物碳源利用特征變化
根據(jù)ECO板上31種碳源的結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)，將其分為6大類(lèi)碳源化合物[17]:糖類(lèi)7種；羧酸類(lèi)9種；胺類(lèi)2種；氨基酸類(lèi)6種；聚合物類(lèi)4種；其他類(lèi)3種。對(duì)培養(yǎng)120h 6類(lèi)碳源化合物的AWCD值進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示，首先，各粒徑土壤團(tuán)聚體中微生物對(duì)6類(lèi)碳源化合物利用率4種處理也呈B2.5>B10>CK>B0的規(guī)律。顯而易見(jiàn)，重金屬Cd抑制土壤微生物對(duì)各類(lèi)碳源化合物的利用，生物質(zhì)炭對(duì)Cd污染土壤微生物碳源利用能力具有恢復(fù)效應(yīng)，2.5%生物質(zhì)炭添加量的恢復(fù)效果最明顯，甚至還有一定的提升作用。這吻合于土壤微生物整體代謝活性，功能多樣性指數(shù)的分析結(jié)果。其次，各處理下土壤微生物6類(lèi)碳源利用強(qiáng)度的峰值現(xiàn)于5~1mm、<0.25mm粒徑團(tuán)聚體中，谷值現(xiàn)于1~0.25mm粒徑團(tuán)聚體中。
由圖3顯示，土壤團(tuán)聚體中4個(gè)處理在PC軸上分異明顯且團(tuán)聚體粒徑大小不同4個(gè)處理坐標(biāo)位置也不同。5~0.25mm土壤團(tuán)聚體B0和CK 2個(gè)處理組離散距離近，可得，單施Cd處理組與空白對(duì)照組的碳源利用能力相似，而<0.25mm土壤團(tuán)聚中B0與其余3個(gè)處理組離散距離都遠(yuǎn)，說(shuō)明B0與B2.5、B10、CK處理組之間碳源利用能力差異顯著。各粒徑團(tuán)聚體中，B0與B2.5、B10的距離都遠(yuǎn)，表明，Cd脅迫下土壤微生物碳源利用能力減弱，生物質(zhì)炭的施入具有一定程度的提升作用。
縱觀土壤微生物6大類(lèi)碳源利用率從高到低依次為：聚合物類(lèi)（24.57%）、其他類(lèi)（20.82%）、糖 類(lèi)（19.42%）、 氨 基 酸 類(lèi)（17.54%）、 羧 酸 類(lèi)（10.02%）、胺類(lèi)（7.63%）。說(shuō)明，聚合物類(lèi)為多數(shù)團(tuán)聚體中微生物代謝的優(yōu)勢(shì)碳源類(lèi)群，羧酸類(lèi)、胺類(lèi)為2類(lèi)劣勢(shì)代謝類(lèi)群。其中，與單加Cd的B0對(duì)照組相比，土壤團(tuán)聚體中生物質(zhì)炭大幅提高了胺類(lèi)、羧酸類(lèi)、糖類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)碳源化合物的微生物利用能力，分別是B0組的4倍、3倍、3倍、3倍、2倍；而其他類(lèi)化合物僅是B0組的1倍�？梢�(jiàn)，除其他類(lèi)化合物外，生物質(zhì)炭顯著提升其余5類(lèi)化合物利用能力，從相反視角來(lái)看，重金屬Cd刺激了土壤微生物利用其他類(lèi)化合物。土壤團(tuán)聚體粒徑大小不同，生物質(zhì)炭輸入對(duì)Cd污染土壤中6大類(lèi)碳源化合物的微生物利用能力是具有選擇性的提升，<0.25mm團(tuán)聚體生物質(zhì)炭添加后微生物對(duì)胺類(lèi)、糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)、其他類(lèi)的利用能力分別是B0組的6倍、4倍、4倍、3倍、3倍、1倍，超出了6類(lèi)碳源化合物提升的平均水平，表明生物質(zhì)炭對(duì)<0.25mm粒徑團(tuán)聚體中碳源化合物的利用率提升作用最顯著。
2.4 不同處理下土壤團(tuán)聚體微生物碳源利用特征主成分分析
為了進(jìn)一步了解不同處理下土壤微生物的碳源利用能力的差異，對(duì)不同土壤團(tuán)聚體中各處理120h下31類(lèi)碳源進(jìn)行主成分分析（PCA）。經(jīng)分析，6個(gè)團(tuán)聚體中31類(lèi)碳源中均提取了不少于7個(gè)的與土壤微生物碳源利用相關(guān)的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率均大于90%.由于主成分1（PC1）、主成分2（PC2）的方差貢獻(xiàn)率較其余主成分大，各粒徑土壤團(tuán)聚體中都選取這2個(gè)能聚集單一碳源的變量數(shù)據(jù)變異主成分作圖剖析。
表3可知，>5mm土壤團(tuán)聚體中，對(duì)PC1貢獻(xiàn)大的（特征向量系數(shù)>0.5）有4種碳源化合物，分別是氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖醛酸、D-蘋(píng)果酸）、胺類(lèi)（腐胺）和聚合物類(lèi)（吐溫40）。對(duì)PC2貢獻(xiàn)大的碳源化合物有3種，糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰D-葡萄糖氨、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸、a-丁酮酸）和胺類(lèi)（苯乙胺）。PC1和PC2共占微生物群落碳源利用率總變異的38.35%,是變異的主要來(lái)源。4種處理組土壤微生物在羧酸類(lèi)、糖類(lèi)和胺類(lèi)的利用上差異顯著；5~2mm中對(duì)PC1貢獻(xiàn)大的有5種碳源化合物，糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（衣康酸、a-丁酮酸）、胺類(lèi)（苯乙胺）、氨基酸類(lèi)（L-苯丙氨酸）和其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖）。對(duì)PC2貢獻(xiàn)大的碳源化合物有糖類(lèi)（D-木糖-戊醛糖）、羧酸類(lèi)（4-羥基苯甲酸）、胺類(lèi)（腐胺）和其他類(lèi)（D,L-a磷酸甘油）。2個(gè)主成分占總變異的35.87%,糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、胺類(lèi)是促使4個(gè)處理產(chǎn)生差異的主要碳源化合物；2~1mm中糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纖維二糖）、聚合物類(lèi)（吐溫40、吐溫80、a-環(huán)式糊精、肝糖）、羧酸類(lèi)（r-羥丁酸、D-蘋(píng)果酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類(lèi)（腐胺）和其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖）對(duì)PC1貢獻(xiàn)大。糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、a-D-乳糖）、聚合物類(lèi)（吐溫40、肝糖）、氨基酸類(lèi)（L-天門(mén)冬酰胺、L-蘇氨酸）和胺類(lèi)（苯乙胺）對(duì)PC2貢獻(xiàn)大。2個(gè)主成分占總變異的43.81%,糖類(lèi)、聚合物類(lèi)、氨基酸類(lèi)和胺類(lèi)碳源化合物導(dǎo)致4個(gè)處理碳源利用差異明顯，而聚合物類(lèi)4種全部碳源均對(duì)2個(gè)主成分貢獻(xiàn)突出，是差異產(chǎn)生的主控因子；1~0.5mm中4類(lèi)碳源化合物對(duì)PC1貢獻(xiàn)大，羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內(nèi)酯、2-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、r-羥丁酸）、糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、D-纖維二糖）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-天門(mén)冬酰胺、L-蘇氨酸）和聚合物類(lèi)（肝糖）。對(duì)PC2貢獻(xiàn)大的有羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸、衣康酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸）、胺類(lèi)（苯乙胺）。2個(gè)主成分占總變異的37.56%,4個(gè)處理碳源利用差異顯著的關(guān)鍵因子是羧酸、氨基酸2類(lèi)碳源化合物；0.5~0.25mm土壤團(tuán)聚中，PC1貢獻(xiàn)大的有4類(lèi)碳源化合物，羧酸類(lèi)（2-羥基苯甲酸、a-丁酮酸）、糖類(lèi)（D-木糖-戊醛糖、i-赤蘚糖醇）、胺類(lèi)（苯乙胺）和聚合物類(lèi)（吐溫80）。PC2貢獻(xiàn)大的有3類(lèi)碳源化合物，羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸）、聚合物類(lèi)（吐溫40、吐溫80）、其他類(lèi)（1-磷酸葡萄糖、D,L-a磷酸甘油）。2個(gè)主成分占總變異的33.34%,羧酸類(lèi)、聚合物類(lèi)碳源化合物致使4個(gè)處理碳源利用差異顯著；<0.25mm中糖類(lèi)（β-甲基-D-葡萄糖苷、D-甘露醇、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖醛酸、4-羥基苯甲酸、D-蘋(píng)果酸）、氨基酸類(lèi)（L-精氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸）、聚合物類(lèi)（吐溫40）和其他類(lèi)（丙酮酸甲酯）對(duì)PC1貢獻(xiàn)大。糖類(lèi)（i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-纖維二糖、a-D-乳糖）、羧酸類(lèi)（D-半乳糖酸r內(nèi)酯、a-丁酮酸）對(duì)PC2貢獻(xiàn)大。2個(gè)主成分占總變異的45.80%,4個(gè)處理在糖類(lèi)與羧酸類(lèi)碳源化合物的利用上差異明顯。綜上，羧酸類(lèi)、糖類(lèi)是4個(gè)處理之間碳源利用能力差異顯著的主要影響因子。圖3坐標(biāo)軸上，各粒徑土壤團(tuán)聚體中B0與B2.5、B10 2個(gè)處理組之間分異最明顯，因而，生物質(zhì)炭處理組與單施Cd處理組碳源利用上起區(qū)分作用的是羧酸類(lèi)和糖類(lèi)碳源化合物。
3 討論
土壤環(huán)境質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)包括土壤微生物種群特征、代謝活性和功能多樣性。本文研究顯示，各土壤團(tuán)聚體中微生物的整體代謝活性、功能多樣性、碳源利用特征4個(gè)處理均呈現(xiàn)B2.5>B10>CK>B0的趨勢(shì)，表明重金屬Cd脅迫下土壤微生物的代謝功能多樣性明顯降低，生物質(zhì)炭轉(zhuǎn)變土壤微生物的代謝模式，緩解并提升功能多樣性，尤其2.5%低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的生物質(zhì)炭添加量提升效果最顯著。重金屬Cd、Cu污染條件下木炭等改良劑修復(fù)可改善土壤微生物群落代謝功能多樣性[18]證實(shí)了本文研究結(jié)論。土壤微生物只能利用生物質(zhì)炭一小部分易分解的碳源[19],因而生物質(zhì)炭中C組分對(duì)Cd污染條件下土壤微生物的功能多樣性變化影響并不顯著。一方面，生物質(zhì)炭物理結(jié)構(gòu)空間大直接吸附土壤微生物于孔隙中，成為土壤微生物生活的載體，同時(shí)供給N、P、K、Ca等土壤微生物生長(zhǎng)代謝必不可少的營(yíng)養(yǎng)元素；另一方面，生物質(zhì)炭可通過(guò)吸附土壤中的重金屬Cd,降低其生物毒性，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生保護(hù)作用。張陽(yáng)陽(yáng)等[20]的研究結(jié)果也為此做了輔證。但土壤微生物的豐度、Cd消減效果這2者與生物質(zhì)炭添加量并不一定成正比例關(guān)系。生物質(zhì)炭施用量高，土壤微生物生物量碳反而低[21],尤其易阻礙低養(yǎng)分土壤中固氮菌的生長(zhǎng)[22].重金屬Cd污染稻田經(jīng)生物質(zhì)炭修復(fù)后，1%低質(zhì)量分?jǐn)?shù)生物質(zhì)炭用量下土壤中有效態(tài)Cd顯著下降，稻粒中Cd含量也隨之降低[23].本文中生物質(zhì)炭添加量和生物質(zhì)炭對(duì)土壤微生物功能多樣性提升效果未呈直接線(xiàn)性關(guān)系，可能是實(shí)驗(yàn)供試土壤為紅壤，養(yǎng)分含量低，2.5%低質(zhì)量分?jǐn)?shù)生物質(zhì)炭用量下微生物豐度更高，且能更有效的降低Cd的微生物有效性。然而，生物質(zhì)炭添加量并不是Cd污染條件下土壤微生物功能多樣性提升的唯一制約因子，還可能與土壤養(yǎng)分變動(dòng)息息相關(guān)，它受土壤有機(jī)質(zhì)、N、P、K含量所制約[24].
土壤團(tuán)聚體粒徑大小對(duì)微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)比p H值等其它因素有更大影響[25],微生物代謝功能多樣性因土壤團(tuán)聚體粒徑大小不同表現(xiàn)出差異。本研究表明各處理下土壤微生物的整體代謝活性、功能多樣性、碳源利用特征峰值均在5~1mm、<0.25mm粒徑團(tuán)聚體中，谷值均在1~0.5mm粒徑團(tuán)聚體中。土壤微生物代謝功能多樣性在不同團(tuán)聚體中呈“v”型分布，分析其原因。首先，土壤大團(tuán)聚體中生物質(zhì)炭通過(guò)改善土壤團(tuán)聚體理化性質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量，直接影響微生物的代謝功能多樣性。土壤中有機(jī)質(zhì)的含量隨團(tuán)聚體直徑的增大逐漸遞增[26],為大團(tuán)聚體微生物提供充足的養(yǎng)分。土壤微生物功能多樣性與土壤總有機(jī)碳含量呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系[27].安艷等[28]研究表明，生物質(zhì)炭輸入后有機(jī)碳含量在5~1mm粒級(jí)團(tuán)聚體中大幅增加。土壤團(tuán)聚體含量增加可改善土壤結(jié)構(gòu)和碳匯能力。有研究就顯示生物質(zhì)炭施用到紅壤后，>1mm粒級(jí)團(tuán)聚體含量呈增加趨勢(shì)，土壤總有機(jī)碳在大團(tuán)聚體中分配的比例也隨之增加[29].本文5~0.25mm大團(tuán)聚體中土壤微生物代謝功能多樣性與團(tuán)聚體粒徑大小呈負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)、有機(jī)碳等微生物可利用底物含量，隨著團(tuán)聚體粒級(jí)的減小而逐漸減少。其次，土壤微團(tuán)聚體中生物質(zhì)炭鈍化重金屬Cd,降低生物有效性間接影響微生物代謝功能多樣性。生物質(zhì)炭鈍化作用受不同粒級(jí)團(tuán)聚體重金屬的富集特征束縛。微團(tuán)聚體的外源Cd含量占全土中Cd含量的91.0%,微團(tuán)聚體是Cd的主要富集場(chǎng)所[30].5~0.25mm大團(tuán)聚體土壤微生物代謝功能多樣性呈下降趨勢(shì)，<0.25mm微團(tuán)聚體中又大幅回升。這是Cd大量分布在微團(tuán)聚體中，生物質(zhì)炭Cd鈍化效果比大團(tuán)聚體更顯著所致。最后，土壤微生物功能多樣性還受微生物本身情況約束。2~0.25mm團(tuán)聚中細(xì)菌、放線(xiàn)菌和微生 物 總 量 隨 團(tuán) 聚 體 粒 徑 增 大 逐 漸 增 加，而<0.25mm團(tuán)聚體中隨粒徑的減小呈減少趨勢(shì)[31].5~1mm大團(tuán)聚體中土壤微生物數(shù)量規(guī)模較大造成總體微生物碳源利用、代謝強(qiáng)度大，代謝功能多樣性高。<0.25mm微團(tuán)聚體中土壤微生物數(shù)量規(guī)模小，但生物質(zhì)炭很大程度恢復(fù)Cd毒害的微生物代謝功能多樣性。文中<0.25mm的微團(tuán)聚體中與其余3組處理相比，單施Cd的B0處理組微生物整體代謝活性明顯降低，生物質(zhì)炭對(duì)功能多樣性、6類(lèi)碳源化合物利用率的提升效果顯著。B0與CK空白對(duì)照碳源利用能力大團(tuán)聚體中相似，微團(tuán)聚體中則大相徑庭。這些現(xiàn)象均與上述原因緊密相關(guān)，當(dāng)然，不同種類(lèi)土壤微生物的團(tuán)聚體空間分異特征及其對(duì)各類(lèi)碳源利用的選擇性也是其影響因子之一。
3種土壤功能多樣性指數(shù)解析闡明，Cd污染土壤中微生物群落物種的均一度對(duì)生物質(zhì)炭響應(yīng)最靈敏，群落中常見(jiàn)的微生物物種卻沒(méi)有太大響應(yīng)。張仕穎等[32]研究顯示，有機(jī)農(nóng)藥輸入后土壤微生物的碳源利用能力集中，Simpson指數(shù)升高。研究中Simpson指數(shù)基本無(wú)變化，微生物對(duì)碳源利用能力均一，微生物分布均勻所以微生物均一度指數(shù)高。6類(lèi)碳源化合物分析可得，重金屬Cd脅迫下土壤微生物偏好于其他類(lèi)碳源化合物。低等程度有機(jī)污染刺激土壤中微生物利用胺/氨基化合物[33].重金屬?gòu)?fù)合污染程度與土壤微生物多樣性不完全呈負(fù)相關(guān)，中等污染程度多樣性指數(shù)高，微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，某些抗重金屬菌群出現(xiàn)[34].本實(shí)驗(yàn)外源Cd的用量為2.5mg/kg,模擬的是中低濃度Cd污染條件。耐Cd的抗性菌株在中低濃度污染的刺激下形成，且對(duì)其他類(lèi)碳源具有偏嗜性。主成分分析表示，生物質(zhì)炭處理組與單施Cd處理組碳源利用上起區(qū)分作用的是羧酸類(lèi)和糖類(lèi)碳源化合物。有實(shí)驗(yàn)表明，重金屬污染條件下，糖類(lèi)、羧酸類(lèi)和氨基酸類(lèi)3類(lèi)化合物對(duì)土壤微生物的代謝模式起分異作用[35],這與本文結(jié)果較相似。本文利用Biolog微平板法探究外源Cd條件下生物質(zhì)炭輸入后不同粒級(jí)團(tuán)聚體微生物在碳源代謝功能多樣性方面的響應(yīng)機(jī)制。Biolog板中碳源底物種類(lèi)有限，而土壤微生物的數(shù)量龐大，種類(lèi)繁多，研究中所得代謝多樣性類(lèi)型不一定反映整個(gè)土壤微生物多樣性，只代表了可培養(yǎng)微生物。生物質(zhì)炭-重金屬Cd的耦合作用下，土壤微生物在微團(tuán)聚體中的變化趨勢(shì)及規(guī)律同樣錯(cuò)綜復(fù)雜，本研究對(duì)微團(tuán)聚體中微生物多樣性探究尚未深入。因而有必要把研究視角切換到分子生物學(xué)上進(jìn)一步深入探究土壤微團(tuán)聚體中微生物的種群結(jié)構(gòu)及多樣性。
4 結(jié)論
4.1 重金屬Cd脅迫下土壤微生物偏好其他類(lèi)碳源化合物，代謝功能多樣性下降。生物質(zhì)炭施用起到一定的恢復(fù)效應(yīng)并使微生物代謝模式發(fā)生轉(zhuǎn)變，2個(gè)生物質(zhì)炭處理組與單加Cd對(duì)照在羧酸類(lèi)、糖類(lèi)碳源化合物利用上差異明顯。但生物質(zhì)炭 這 種 恢 復(fù) 效 應(yīng) 與 施 加 量 并 不 呈 線(xiàn) 性 關(guān)系，2.5mg/kg生物質(zhì)炭用量作用效果最顯著。表明此生物質(zhì)炭量對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)安全的微生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)有很強(qiáng)的規(guī)避性。
4.2 土壤微生物的代謝功能多樣性在不同粒級(jí)團(tuán)聚中呈“V”型分布。5~0.25mm大團(tuán)聚體Cd污染土壤微 生 物碳源利 用 能力與空 白 對(duì)照相似，<0.25mm微團(tuán)聚體中差異顯著，此團(tuán)聚體中Cd土壤中微生物代謝功能多樣性脅迫效應(yīng)最強(qiáng)，生物質(zhì)炭的保護(hù)效應(yīng)也最明顯。
參考文獻(xiàn)：
[1] 安紅敏，鄭偉，高揚(yáng)。鎘的健康危害及干預(yù)治療研究進(jìn)展[J].環(huán)境與健康雜志， 2007,（9）：739-742.
[2] 全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)[N].中國(guó)環(huán)境報(bào)， 2014-04-18.
[3] Beesley L, Moreno-Jiménez E, Gomez-Eyles J L. Effects ofbiochar and greenwaste compost amendments on mobility,bioavailability and toxicity of inorganic and organic contaminantsin a multi-element polluted soil [J]. Environmental Pollution,2010,158（6）：2282-2287.
[4] 王海波。秸稈生物質(zhì)炭對(duì)污染土壤鎘形態(tài)轉(zhuǎn)化的影響及作用機(jī)制研究[D].昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.[5] 徐楠楠，林大松，徐應(yīng)明，等。玉米秸稈生物炭對(duì)Cd2+的吸附特性及影響因素[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2014,33（5）：958-964.
[6] 劉晶晶，楊興，陸扣萍，等。生物質(zhì)炭對(duì)土壤重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化及其有效性的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2015,35（11）：3679-3687.
[7] 張彥，張惠文，蘇振成，等。長(zhǎng)期重金屬脅迫對(duì)農(nóng)田土壤微生物生物量、活性和種群的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2007,18（7）：1491-1497.
[8] 林海，崔軒，董穎博，等。銅尾礦庫(kù)重金屬Cu、Zn對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2014,34（12）：3182-3188.
[9] Ernst Maier-Reimer, Uwe Mikolajewiezz, Arne Winguth. Futureocean uptake of CO2;interaction between ocean circulation andbiology [J]. Climate Dynamies.1996,12（10）：711-722.
[10] 李明，李忠佩，劉明，等。不同秸稈生物炭對(duì)紅壤性水稻土養(yǎng)分及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015,48（7）：1361-1369.
[11] 宋延靜，張曉黎，龔駿。添加生物質(zhì)炭對(duì)濱海鹽堿土固氮菌豐度及群落結(jié)構(gòu)的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志， 2014,33（8）：2168-2175.
[12] Emerson W W, Foster R C, Oades J M. Organo-mineralcomplexes in relation to soil aggregation and structure [J]. Ininteractions of soil mineral with natural organic and microbes,1986,（17）：521-54.
[13] Elliott E T. Aggregate structure and carbon,nitrogen,andphosphorus in native and cultivated soils [J]. Soil Science Societyof America Journal [J]. 1986,50（3）：627-633.
[14] Classen A T, Boyle S I, Haskins K E, et al. Community-levelphysiological profiles of bacteria and fungi: plate type andincubation temperature influences on contrasting soils [J]. FEMSMicrobiology Ecology, 2003,44（3）：319-328.
[15] 田雅楠，王紅旗。 Biolog法在環(huán)境微生物功能多樣性研究中的應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)， 2011,34（3）：50-57.
[16] Atlas R M. Diversity of microbial communities [M]. Advances inMicrobial Ecology, 984,7:1–47.
[17] Preston-Mafham J, Boddy L, Randerson P F. Analysis ofmicrobial community functional diversity using sole-carbon- source utilisation profiles–a critique [J]. FEMS MicrobiologyEcology, 2002,42（1）：1-14.
[18] 崔紅標(biāo)，范玉超，周靜，等。改良劑對(duì)土壤銅鎘有效性和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2016,36（1）：197-205.
[19] Maestrini B, Herrmann A M, Nannipieri P, et al. Ryegrass-derived pyrogenic organic matter changes organic carbon andnitrogen mineralization in a temperate forest soil [J]. Soil Biology& Biochemistry, 2014.69:291-301.
[20] 張陽(yáng)陽(yáng)，胡學(xué)玉，余忠，等。Cd脅迫下城郊農(nóng)業(yè)土壤微生物活性對(duì)生物炭輸入的響應(yīng)[J].環(huán)境科學(xué)研究， 2015,28（6）：936-942.
[21] Dempster D N, Gleeson D B, Solaiman Z M, et al. Decreased soilmicrobial biomass and nitrogen mineralisation with eucalyptusbiochar addition to a coarse textured soil. Plant and Soil, 2012,354（1/2）：311-324.
[22] Rondon M A, Lehmann J, Ramirez J, et al. Biological nitrogenfixation by common beans （Phaseolus vulgaris L） increases withbio-char additions [J]. Biology and Fertility of Soils, 2007,43:699-708.
[23] 王維，倉(cāng)龍，俞元春，等。生物質(zhì)炭施用和不同水分管理對(duì)水稻生長(zhǎng)和Cd吸收的影響[J].安全與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2015,15（5）：310-314.
[24] 彭芳芳，羅學(xué)剛，王麗超，等。鈾尾礦周邊污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與功能研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013,32（11）：2192-2198.
[25] Sessitsch A, Weilharter A, Gerzabek M H, et al. Rapididentification and discrimination among Egyptian genotypes ofRhizobium leguminosarum bv viciae and Sinorhizobium melilotinodulating faba bean （Vicia faba L.） by analysis of nod C,ARDRA, and r DNA sequence analysis [J]. Soil Biology andBiochemistry, 2009,41:45-513.
[26] 楊瑩瑩，魏兆猛，黃麗，等。不同修復(fù)措施下紅壤大團(tuán)聚體中有機(jī)質(zhì)分布特征[J].水土保持學(xué)報(bào)， 2012,26（3）：154-158.
[27] 杜毅飛，方凱凱，王志康，等。生草果園土壤微生物群落的碳源利用特征[J].環(huán)境科學(xué)， 2015,36（11）：45.
[28] 安艷，姬強(qiáng)，趙世翔，等。生物質(zhì)炭對(duì)果園土壤團(tuán)聚體分布及保水性的影響[J].環(huán)境科學(xué)， 2016,（1）：93-300.
[29] 吳鵬豹，解鈺，漆智平，等。生物炭對(duì)花崗巖磚紅壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性及其總碳分布特征的影響[J].草地學(xué)報(bào)， 2012,20（4）：643-649.
[30] 王圓方，朱寧，顏麗，等。外源Cd2+在土壤各級(jí)微團(tuán)聚體中的含量和形態(tài)分布[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2009,18（4）：1764-1766.
[31] 李清華，王飛，林誠(chéng)，等。長(zhǎng)期施肥對(duì)黃泥田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及團(tuán)聚體組分特征的影響[J].植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2015,21（6）：1599-1606.
[32] 張仕穎，夏運(yùn)生，肖煒，等。除草劑丁草胺對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物群落功能多樣性的影響[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)， 2013,22（5）：815-819.
[33] 鄭麗萍，龍濤，林玉鎖，等。Biolog-ECO解析有機(jī)氯農(nóng)藥污染場(chǎng)地土壤微生物群落功能多樣性特征[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2013,19（5）：759-765.
[34] 謝學(xué)輝，范鳳霞，袁學(xué)武，等。德興銅礦尾礦重金屬污染對(duì)土壤中微生物多樣性的影響[J].微生物學(xué)通報(bào)， 2012,39（5）：624-637.
[35] 魏志強(qiáng)，王慧，胡洪營(yíng)，等。海河-渤海灣沿線(xiàn)地區(qū)沉積物中微生物群落代謝特征 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2008,28（5）：1007-1013.
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