廣東土牛膝及咽炎方合劑中12,13-二羥基澤蘭素對照品的制備

　　【摘要】  目的從廣東土牛膝中制備咽炎方合劑中的特征成分12,13-二羥基澤蘭素對照品。方法結(jié)合液液萃取、硅膠柱色譜、制備型高效液相色譜(HPLC)對廣東土牛膝醇提物進(jìn)行分離純化，通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振(NMR)等進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，分析型HPLC和薄層色譜(TLC)進(jìn)行含量測定。結(jié)果制得的對照品為12,13-二羥基澤蘭素，含量大于98.0%。結(jié)論該化合物可作為廣東土牛膝及咽炎方合劑的質(zhì)量控制以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究用的化學(xué)對照品。

　　【關(guān)鍵詞】  廣東土牛膝; 咽炎方合劑; 12,13-二羥基澤蘭素; 對照品

　　Abstract：Objective To prepare 12,13-dihydroxyeuparin reference substance from Radix Eupatorii Chinensis, the characteristic composition in Yanyanfang Mixture. MethodsThe extract of Radix Eupatorii Chinensis was isolated and purified by liquid-liquid extraction, silica gel column chromatography and preparative high performance liquid chromatography(HPLC). The structure of 12,13-dihydroxyeuparin was identified by ultraviolet spectra (UV), infrared spectra(IR), mass spectra(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR). The content was determined by analytical HPLC and thin-layer chromatography (TLC).ResultsThe content of the product was higher than 98%.ConclusionThe compound can be used as a reference substance for quality control and the research of pharmacodynamic action.

　　Key words：Radix Eupatorii Chinensis; Yanyanfang Mixture; 12,13-dihydroxyeuparin; Reference substance

　　廣東土牛膝Radix Eupatorii Chinensis為菊科植物華澤蘭Eupatorium chinense L.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮(zhèn)痛的功效[1,2]，有喉科圣藥之稱。以廣東土牛膝為主藥的復(fù)方制劑在廣東地區(qū)的醫(yī)院里被廣泛使用，但國內(nèi)有關(guān)廣東土牛膝在復(fù)方制劑中的特征成分未見報道。本實驗對廣東土牛膝藥材及其復(fù)方制劑咽炎方合劑(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院研制)進(jìn)行化學(xué)成分研究，首次從該植物中分離得到12,13-二羥基澤蘭素(12,13-dihydroxyeuparin)，符合中藥化學(xué)對照品的相關(guān)要求[3,4]，可用于該藥材和咽炎方合劑的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

　　1 儀器與材料

　　BIO-RAD制備型液相色譜儀，Waters1525分析型高效液相色譜儀(2996PAD檢測器，Empower色譜工作站)，Bruker AvanceⅢ 400MHz核磁共振波譜儀，島津LCMS-IT-TOF質(zhì)譜儀，Bruker Tensor 37傅立葉變換紅外光譜儀，SRS Optimelt熔點測定儀，WFH-203B三用紫外分析儀，亞榮RE-300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

　　廣東土牛膝購于廣州市藥材公司，由中山大學(xué)藥學(xué)院徐新軍博士鑒定，咽炎方合劑由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供。薄層硅膠和柱層析硅膠(青島海洋化工廠);甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

　　2 方法與結(jié)果

　　2.1 色譜條件

　　2.1.1 分析型HPLC：迪馬Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);檢測波長205～400 nm;柱溫為室溫，流速1 ml·min-1，進(jìn)樣量20 μl。流動相為0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度1洗脫(咽炎方制劑分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～60 min，乙腈40%～60%。0.2%磷酸水溶液-乙腈梯度2洗脫(藥材萃取物分析)：0～10 min，乙腈10%;10～40 min，乙腈10%～40%;40～50 min，乙腈40%;50～65 min，40%～80%乙腈;65～80 min，乙腈80%。0.2%磷酸水溶液-乙腈(80∶20，對照品純度分析)。

　　2.1.2 制備型HPLCKromasil C18柱(10 mm×250 mm，5 μm)，流動相為水-甲醇(65∶35);檢測波長254 nm，流速5 ml·min-1，進(jìn)樣量0.5 ml。

　　2.2 廣東土牛膝在咽炎方合劑中的特征成分確定咽炎方合劑系由廣東土牛膝、崗梅、甘草等中藥水煎煮濃縮而成，廣東土牛膝是方中君藥。用HPLC對咽炎方合劑、廣東土牛膝水煮液和乙醇提液、咽炎方缺廣東土牛膝陰性溶液進(jìn)行分析，選擇廣東土牛膝在制劑中峰面積最大的成分作為分離純化目標(biāo)。如圖1所示，峰1為咽炎方合劑與廣東土牛膝水煮液相對應(yīng)的色譜峰，確定其為目標(biāo)化合物。由于峰1在廣東土牛膝乙醇提取液中含量較高，選擇用95%乙醇提取廣東土牛膝藥材，制取浸膏供分離對照品用。

　　2.3 對照品的分離與制備取廣東土牛膝藥材3 kg，粉碎，95%乙醇回流提取2次，1.5 h/次。合并提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物50 g。取乙醇提取物與水混懸，依次以石油醚、乙醚、正丁醇萃取，得石油醚萃取物23 g，乙醚萃取物3.6 g和正丁醇萃取物5 g。分別取3種萃取物進(jìn)行HPLC分析(見圖2)發(fā)現(xiàn)擬分離化合物主要在乙醚萃取層。取乙醚萃取物干法上樣于硅膠(200～300目)柱，二氯甲烷-丙酮(16∶1)洗脫，合并薄層色譜斑點相同部分，得到粗品0.4 g，經(jīng)HPLC面積歸一化法計算，擬分離化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%。A?咽炎方樣品溶液 B?咽炎方廣東土牛膝缺位樣品溶液　　C?廣東土牛膝乙醇提取液 D?廣東土牛膝水煮液 1.目標(biāo)化合物　圖1 供試品溶液色譜圖(254 nm)A?石油醚萃取物 B?乙醚萃取物 C?正丁醇萃取物 1.目標(biāo)化合物圖2 萃取物色譜圖(240 nm)將粗品溶于50 ml 35%甲醇，作為制備液相色譜供試品溶液。按制備型HPLC色譜條件對粗品進(jìn)行純化，收集保留時間在20～23 min的組分(見圖3)在50℃減壓濃縮后冷凍干燥，得淡黃色粉末100 mg。圖3 供試品溶液的制備型HPLC圖

　　2.4 結(jié)構(gòu)鑒定淡黃色針狀結(jié)晶(甲醇)。熔點121～122 ℃。UV(MeOH)λmax nm：240，265，348。IR(KBr)νmax cm-1：3440，2446，1643，1384，1163，1070，950，860，547。ESI-MS:：m/z 249.0759[M-H]-，確定分子式為C13H14O5。NMR數(shù)據(jù)見表1　NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道基本一致[5]，確定其結(jié)構(gòu)為12，13-二羥基澤蘭素，結(jié)構(gòu)見圖4，為首次從該植物中分離得到。

　　2.5 對照品的純度檢測

　　2.5.1 HPLC檢測取對照品適量，用甲醇配成濃度為250 μg·ml-1的溶液，按色譜條件進(jìn)樣分析，對照品主峰與雜質(zhì)峰分離度為8.2。色譜圖見圖5。用Empower軟件計算得到對照品主峰的純度角度為0.42，純度閾值為0.71，角度和閾值均小于1，且前者小于后者。根據(jù)Waters色譜工作站的色譜峰純度理論，表明對照品的峰光譜均勻，純度較高，可認(rèn)為是單一物質(zhì)峰。

　　2.5.2 TLC檢測取對照品用甲醇配制成濃度為5.0 mg·min-1的溶液，做為供試液，另取供試液稀釋成濃度為0.1 mg·min-1，作為對照液，取供試液和對照液各10 μl點于同一硅膠板上，以二氯甲烷-丙酮(7∶1)為展開劑，以10%硫酸乙醇為顯色劑，105 ℃加熱3 min，置紫外燈365 nm下觀測，供試液除主斑點外，只出現(xiàn)一個雜質(zhì)斑點，且小于對照液，表明制得的對照品含量大于98.0%。表1 對照品的NMR數(shù)據(jù)　圖4 12，13-二羥基澤蘭素結(jié)構(gòu)式圖5 12，13-二羥基澤蘭素的分析型HPLC圖

　　3 討論

　　以廣東土牛膝為主藥的復(fù)方制劑在廣東地區(qū)的醫(yī)院常被用于治療急慢性咽喉炎、扁桃體炎等咽喉疾病，療效確切，但由于其為地方藥材，對照品的缺失成為其質(zhì)量控制的瓶頸，藥材及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直未有含量測定方法[6]，廣東土牛膝復(fù)方制劑的質(zhì)量控制主要有對廣東土牛膝進(jìn)行薄層鑒別[7，8]，測定制劑的總黃酮含量[7，9]等，對制劑中廣東土牛膝的化學(xué)成分研究很少。本實驗通過分析咽炎方合劑中廣東土牛膝的特征成分，結(jié)合廣東土牛膝水提液的指紋圖譜，選取兩者均含有的成分作為定量指標(biāo)的目標(biāo)化合物，進(jìn)行分離、純化，得到12，13-二羥基澤蘭素，可作為廣東土牛膝藥材和咽炎方合劑的質(zhì)量控制以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究用的化學(xué)對照品。

　　在用制備液相色譜純化前，先把乙醚層萃取物通過硅膠柱色譜預(yù)處理，初步凈化去除了樣品中大量的雜質(zhì)，使12,13-二羥基澤蘭素的含量進(jìn)一步提高，防止污染色譜柱。

　　選用205～400 nm的檢測波長對樣品進(jìn)行純度分析，確定主成分峰為單一物質(zhì)峰，表明在此色譜條件下，主成分12，13-二羥基澤蘭素和雜質(zhì)分離完全。

　　HPLC和TLC兩種檢測方法測定對照品純度，含量均大于98.0%，符合中藥對照品要求。

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