IL?6對NIH3T3細(xì)胞MMP?3和TIMP?1表達(dá)影響

                      作者：蘇萌 鄒云雯 褚言琛 楊堃

 

【摘要】  目的 探討白細(xì)胞介素?6(IL?6)對小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶?3(MMP?3)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP?1)表達(dá)的影響。方法 應(yīng)用不同濃度(0、5、10、15、20 mg/L)的IL?6刺激NIH3T3成纖維細(xì)胞，共同培育12 h收集細(xì)胞。應(yīng)用Western blot和 RT?PCR方法分別檢測細(xì)胞內(nèi)MMP?3和TIMP?1的表達(dá)。結(jié)果 MMP?3表達(dá)隨著IL?6濃度的升高而上升，TIMP?1表達(dá)隨著IL?6濃度的升高而下降。結(jié)論 IL?6能影響MMP?3和TIMP?1的表達(dá)平衡，可能是影響硬膜外瘢痕形成的機(jī)制之一。

【關(guān)鍵詞】  白細(xì)胞介素6;瘢痕;基質(zhì)溶解素1;金屬蛋白酶1組織抑制劑

[ABSTRACT] Objective To study the affect of IL?6 on the expressions of MMP?3 and TIMP?1 in NIH3T3 fibroblasts in mice. Methods Different concentrations (0,5,10,15 and 20 mg/L) of IL?6 were applied to stimulate NIH3T3 fibroblasts and culture for 12 h and collect the cells. Western bolt and RT?PCR were employed to detect the expressions of MMP?3 and TIMP?1 within the cells. Results The expression of MMP?3 increased with the rising concentration of IL?6,and TIMP?1 declined. Conclusion IL?6 can affect the balance between the expressions of MMP?3 and TIMP?1, which is, probably, one of the mechanisms of epidural scar formation.

　　[KEY WORDS] interleukin?6; cicatrix; stromelysin 1; tissue inhibitor of metalloproteinase?1

　　大量研究表明，硬膜外瘢痕增生被認(rèn)為是腰椎手術(shù)失敗綜合征(FBSS)的重要原因[1]。硬膜外瘢痕則是由于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的異常沉積所致�；�質(zhì)金屬蛋白酶?3(MMP?3)能降解ECM，其活性受到金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP?1)的抑制，兩者在瘢痕形成中起著重要的作用[2]。本研究應(yīng)用炎癥因子白細(xì)胞介素?6(IL?6)刺激小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞，觀察其中MMP?3和TIMP?1表達(dá)的改變，從而探討IL?6在瘢痕形成中的作用機(jī)制。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 細(xì)胞 小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞(購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)。

　　1.1.2 試劑 IL?6(Sigma公司)，兔抗小鼠MMP?3單抗(Bioworld公司)，兔抗小鼠TIMP?1多抗(Bioworld公司)，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(Santa Cruz Biotechnology 公司)，TRIZOL、RT?PCR kit(TaKaRa公司)。

　　1.1.3 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma，USA);倒置顯微鏡(Olympus,Japan); Western電泳儀;轉(zhuǎn)膜儀(Bio?Rad，USA);PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf,Germeny);VILBER LOURMAT紫外線凝膠成像系統(tǒng)(France)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用第5～8代細(xì)胞，將細(xì)胞按照1×108/L接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁融合達(dá)到80%～90%時(shí)，換無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)18 h，然后加入不同質(zhì)量濃度(0、5、10、15、20 μg/L)的IL?6刺激小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞12 h，收集細(xì)胞。

　　1.2.2 Western blot檢測 細(xì)胞干預(yù)完畢后，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，離心收集上清液，變性的蛋白樣品經(jīng)100 g/L分離膠電泳，恒流轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉過夜，一抗分別用兔抗鼠MMP?3單抗和兔抗小鼠TIMP?1多抗，室溫孵育60 min,二抗用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫孵育60 min, ECL發(fā)光劑作用后曝光顯影。再用Striping buffer清除　PVDF膜上已結(jié)合的一抗和二抗，重新經(jīng)β?Actin一抗、二抗孵育后，再次顯像，作為內(nèi)部參照。

　　1.2.3 RT?PCR 將收集到的細(xì)胞按照TaKaRa試劑說明書采用細(xì)胞總RNA TRIzol試劑提取RNA，用紫外線分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測其濃度和純度。MMP?3上游引物序列：5′?GAGTGTGGA?TTCTGCCATTGAAA?3′，下游引物序列：5′?GCA?AAGGAGATCATTATGTCAGCC?3′;GAPDH的上游引物序列：5′?GCATTGTGGAAGGGCTCA?3′，下游引物序列：5′?GGGTAGGAACACGGAAGG?3′;TIMP?1上游引物序列:5′?CAGTAAGGCCTGTA?GCTGTGCC?3′，下游引物序列：5′?TGTAGGCGTACCGGATATCTGC?3′。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后，溴化乙錠顯色后分析。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　對所得結(jié)果利用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析，將目的條帶吸光度值同相應(yīng)內(nèi)參進(jìn)行比較，所得比值以±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有顯著性。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 Western blot檢測

　　在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)MMP?3的表達(dá)隨著IL?6濃度的升高而升高，TIMP?1的表達(dá)隨著IL?6濃度的升高而下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=186.049、2 145.536，q=2.812～118.686，P<0.05)。見圖1、表1。

　　2.2 RT?PCR檢測

　　以GAPDH為內(nèi)參校正后，不同濃度的IL?6均上調(diào)MMP?3的表達(dá)和下調(diào)TIMP?1的表達(dá)，并且在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)MMP?3的表達(dá)隨著IL?6濃度的加大而升高，TIMP?1的表達(dá)隨著IL?6濃度的加大而下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=296.023、8 180.845，q=4.672～204.382，P<0.05)。見圖2、表2。

　　3 討 論

　　椎板切除術(shù)是脊柱外科最常采用的手術(shù)方式，用來治療腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥和腰椎管內(nèi)腫瘤等脊柱疾病。FBSS是椎板切除術(shù)后最常見的術(shù)后并發(fā)癥之一，發(fā)病率平均為5%～10%[3]。硬脊膜周圍纖維化和瘢痕形成被認(rèn)為是導(dǎo)致FBSS表1 不同濃度IL?

6刺激小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞后MMP?3和TIMP?1蛋白表達(dá)表2 不同濃度IL?6刺激小鼠NIH3T3成纖維細(xì)胞后對MMP?3和TIMP?1 mRNA表達(dá)影響的重要的病理機(jī)制。SONGER等[4]于1990年提出了纖維化形成的三維立體學(xué)說，認(rèn)為硬膜周圍的纖維化既來自于后方損傷的骶脊肌，也來自前方的纖維環(huán)和后縱韌帶，同時(shí)側(cè)方的粘連也導(dǎo)致神經(jīng)根受累,這一觀點(diǎn)目前被大多數(shù)專家所接受和認(rèn)可。目前臨床最常用治療措施是局部或全身應(yīng)用類固醇激素，利用一些半流質(zhì)或膜性物質(zhì)作為物理或化學(xué)屏障隔斷瘢痕與硬脊膜和神經(jīng)根的接觸，以此來預(yù)防硬膜外瘢痕形成;但通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及長期臨床觀察結(jié)果顯示，其不能有效預(yù)防硬膜外瘢痕的形成和FBSS的發(fā)生，而且需要延長手術(shù)時(shí)間和增加病人的失血量[5?6]。因此，利用細(xì)胞因子影響膠原的產(chǎn)生和代謝是防治病理性瘢痕的重要方法。

　　瘢痕主要是由ECM大量沉積所致，ECM的主要成分是膠原，膠原蛋白的異常合成和沉積是導(dǎo)致局部纖維化和瘢痕形成的基礎(chǔ)。MMPs是一組參與ECM降解的蛋白酶，其活性受到TIMPs的抑制。MMP?3能降解多種基質(zhì)蛋白，包括蛋白多糖、纖維連接蛋白、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型膠原，更為重要的是它能激活MMP?1,使其降解膠原的活性升高7～10倍，變?yōu)槌�活性基質(zhì)金屬蛋白酶(SA?MMP?1),并且還能激活MMP?7、MMP?8、MMP?9和MMP?10，從而降解膠原[7?8]。TIMPs是一組抑制MMPs活性的糖蛋白，有TIMP?1、TIMP?2、TIMP?3和TIMP4等4種類型[2]。TIMP?1 能高親和性以1∶1結(jié)合到MMPs形成復(fù)合體，抑制MMP?1、MMP?2、MMP?3活性，促進(jìn)膠原的沉積[9]。IL?6是一種多效能的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IL?6能劑量依賴性上調(diào)MMP?3表達(dá)和下調(diào)TIMP?1的表達(dá)。膠原酶和MMP?3的低表達(dá)是增生性瘢痕組織內(nèi)ECM過度沉積的重要原因[5]。有報(bào)道瘢痕成纖維細(xì)胞低表達(dá)MMP?3，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將MMP?3的基因?qū)�入瘢痕成纖維細(xì)胞后，對ECM的降解力增強(qiáng)，說明MMP?3低表達(dá)是增生性瘢痕組織內(nèi)ECM沉積的重要原因[10]。也有報(bào)道稱在病理性瘢痕中，MMP?1和TIMP?1均高表達(dá)，但TIMP?1相對表達(dá)量更高[11]。一些研究結(jié)果表明,MMPs和TIMPs表達(dá)以及酶活性的異常與創(chuàng)面的不正常愈合有密切的關(guān)系，MMPs的表達(dá)明顯升高會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)面的不愈合,表達(dá)過低會(huì)導(dǎo)致瘢痕形成[12]，如何能在創(chuàng)面中平衡MMPs和TIMPs的表達(dá)將是預(yù)防和治療瘢痕的重要手段。

　　本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，IL?6是能上調(diào)體外培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞MMP?3的表達(dá)和抑制TIMP?1表達(dá)的細(xì)胞因子之一，這為我們進(jìn)一步研究抗瘢痕形成機(jī)制和臨床應(yīng)用抗瘢痕藥物提供了理論依據(jù)。但本實(shí)驗(yàn)僅是體外簡單的細(xì)胞模型，并不能代表生理狀況下人體內(nèi)復(fù)雜的抗瘢痕形成機(jī)制，對于抗瘢痕形成的復(fù)雜機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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