淺析現(xiàn)階段高通量測序中的拼接問題論文

　　摘要：近年來，隨著第二代測序技術(shù)的普及和第三代測序技術(shù)的逐步發(fā)展，高通量測序技術(shù)在實際研究中的應(yīng)用越來越廣泛。高速率、高性價比是其主要優(yōu)點(diǎn)。相對于傳統(tǒng)的桑格（Sanger）法測序來言，高通量測序得到的片段長度較為短小，故如何拼接得到完整的序列一直是炙手可熱的研究方向。本文總結(jié)了現(xiàn)階段高通量測序中拼接問題的研究結(jié)果，針對現(xiàn)在流行的各種算法進(jìn)行了簡單介紹。

　　關(guān)鍵詞：高通量測序；reads 拼接；contigs 組裝；OLC、De brujin 圖

　　一、測序技術(shù)的發(fā)展過程和現(xiàn)狀[1]

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　　桑格法又叫做雙脫氧鏈終止法，由Sanger在1977年提出。通過加入帶有放射標(biāo)記的dd NTP（雙脫氧核苷酸）使DNA合成終止。再通過電泳，并使用放射自顯影技術(shù)讀出堿基。此方法得到的片段較長，能達(dá)到1000bp左右。

　�。ǘ�）第二代測序技術(shù)

　　隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的桑格法已經(jīng)不能滿足研究的需要。科學(xué)家們需要更快的速度、更高的通量以及更低廉的價格，于是第二代測序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。其核心思想是邊合成邊測序。現(xiàn)在主要有454 GS FLX、SOLi D和Illumina/Solexa GenomeAnalyzer三個平臺。第二代測序是現(xiàn)階段測序技術(shù)的主流，也是高通量測序的開始。

　�。ㄈ�）第三代測序技術(shù)

　　第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)。不需要經(jīng)過PCR的過程即可測序，速度可以達(dá)到每秒十個堿基。通量更大，讀長更短，是現(xiàn)階段測序技術(shù)的發(fā)展方向。

　　二、高通量測序中的拼接工作

　�。ㄒ唬└咄�量測序所得片段的特點(diǎn)

　　高通量測序之后所得到的序列片段稱為reads（讀取），其主要特點(diǎn)兩點(diǎn)。一是長度短，一般在200bp以 下，最長的454平臺能達(dá)到的長度也不過1000bp,因此需要進(jìn)行 大量的拼接才能得到整條DNA序列。二是有部分重疊，由于測序位置具有隨機(jī)性，故各reads總會有一定的重疊，這些重疊是拼接工作的關(guān)鍵。

　�。ǘ�）拼接過程

　　整個拼接過程分為兩步。第一步，考察reads的重復(fù)序列，并拼接成更長的片段，稱為contigs（重疊群），這一步稱為reads的拼接；第二步，確定contigs之間的順序關(guān)系，并按此排列，形成稱為scaffolds的序列，這一步叫做contigs的組裝。

　　三、Reads的拼接

　�。ㄒ唬┢唇舆^程的難點(diǎn)

　　reads拼接過程中要克服的難點(diǎn)主 要有兩點(diǎn)，一是高通量測序得到的reads長度較短，故內(nèi)含信息較少，不易確認(rèn)相對順序。二是遠(yuǎn)程連接信息（Long-range linking information）的不可靠性。 2這兩點(diǎn)制約著reads拼接過程的準(zhǔn)確率。

　�。ǘ�）方法[3]

　　reads拼接過程中算法的基本要求是de novo（從頭測序），即不需要任何序列信息即可對原料進(jìn)行測序。由此衍生出兩種主流的算法：

　　1.OLC

　　OLC,即交疊-排列-共有序列算法（Overlap-layout-consensus），是一個比較傳統(tǒng)的算法，其基本思想為根據(jù)reads間的重復(fù)部分，確定可能性的reads連接順序。

　　其步驟為：構(gòu)建交疊圖：對每兩個reads進(jìn)行比對，計算它們的重疊度---排列reads:將reads進(jìn)行排列，確定它們之間的相對位置，建立overlap圖---生成共有序列：通過多序列比對等方法，確立最后的contig.

　　OLC算法的計算量主要體現(xiàn)在交疊圖的構(gòu)建，而高通量測序得到的海量短序列有大量的交疊，往往需要大量的運(yùn)算時間。故OLC算法并不適合現(xiàn)在高通量測序的發(fā)展趨勢。現(xiàn)在某些拼接軟件，如Shorty、CABOG等仍在使用基于此的算法。雖然這些軟件針對OLC算法有一定的改進(jìn)和優(yōu)化，但其拼接速度和準(zhǔn)確性仍受到限制。

　　2.De brujin圖

　　基于De brujin圖（DBG）的算法是現(xiàn)在最流行的算法，許多常用的拼接軟件如Velvet、ABy SS等都在使用這種算法。其特點(diǎn)為把基因序列的拼接問題轉(zhuǎn)化為了數(shù)學(xué)上的圖論問題，大大提高了拼接效率。

　�。�1）基本思想

　　reads中 連 續(xù) 的k個 堿 基 稱 為k -mer,作 為DBG的節(jié)點(diǎn)，兩個k-mer如 果在同一read中 相鄰，則形成一條邊。故每個read都會對一些邊加權(quán)，最后形成一個含有節(jié)點(diǎn)、有權(quán)值的邊的DBG,由此生成最佳的contig.

　�。�2）步驟

　　篩選reads:對reads進(jìn)行檢測，去除掉可能錯誤的reads---確定k值：k的值直接影響速度和精度。 K值較大時，精度有所提高，但更容易受覆蓋率的影響。故應(yīng)該根據(jù)覆蓋率、reads長度等確定合適的k值---處 理DBG:根 據(jù) 確 定 的k值，做 出DBG,同時完成化簡和修正---根據(jù)DBG,拼接成contig.

　�。�3）優(yōu)缺點(diǎn)

　　DBG算法在處理海量短reads的時候效果優(yōu)秀，與現(xiàn)在測序技術(shù)的發(fā)展趨勢相匹配。然而，由于k-mer的長度較短，此方法受重復(fù)序列、測序錯誤的影響較大。

　�。ㄈ�）不同拼接軟件的效果差異

　　不同的拼接軟件在reads拼接過程中表現(xiàn)為三點(diǎn)：一是比起軟件來說，reads質(zhì)量對拼接結(jié)果影響更大；二是與標(biāo)準(zhǔn)序列的接近度隨reads和拼接軟件的不同有很大改變；三是各軟件拼接的正確率差別很大，但與接近度的結(jié)果不一致。

　　四、Contigs的組裝

　　與reads的拼接相比，contigs的組裝的難度相對較小。這是因為contigs的長度較reads長很多，所含信息較多。故可以較為準(zhǔn)確的組裝成scaffold

　�。ㄒ唬┙M裝過程的難點(diǎn)[4]

　　Contigs組 裝 過 程 中 的 難 點(diǎn) 主 要 有 二。一 是contigs中 含有大量的重復(fù)序列，不易確定contigs之間的相對順序；二是由于contigs由reads拼接而成，其中不 免 會 有 一 些 錯 誤，這 些 錯 誤 也 會 對contigs的組裝產(chǎn)生干擾。

　�。ǘ�）方法

　　Contigs組 裝的方法較reads拼 接而言較多，一般常用的有圖論法和光學(xué)圖譜法（Optical mapping）兩種。

　　1.圖論法[5]

　　圖論法是比較傳統(tǒng)的方法，與reads拼接有相似的地方。它以contigs作為節(jié)點(diǎn)，由相連的讀取對（Linking reads pair）作為邊，由此形成算圖。

　　其一般步驟為：庫的構(gòu)建：構(gòu)建出含有所有reads的 庫---計算相連讀取對之 間的距離，并由此計算gap的長度---把長度放在邊上，作為算圖的數(shù)據(jù)。

　　其理想的輸出結(jié)果是一條scaffold序列，對應(yīng)一條染色體，包含以正確順序排 列 的contigs和contigs之間gap的長度。

　　2.光學(xué)圖譜法[6]

　　光學(xué)圖譜法是一種較為新穎的方法。通過內(nèi)切酶將DNA切斷，此時DNA的片段的譜表現(xiàn)出一種特殊的指紋或是識別碼的性質(zhì)。利用光學(xué)方法追蹤此信息得到相對位置，由此組裝成正確的scaffold.

　　主要步驟為：將contigs放 置 在 光 學(xué) 圖 譜上---修正光學(xué)圖譜---做出contigs的連接圖，由此決定最佳的contigs連接順序。

　　光學(xué)圖譜法的組裝結(jié)果有著很高的覆蓋率，巧妙運(yùn)用光學(xué)圖譜法可以獲得很高的成本效益。

　　有研究表明，當(dāng)與454平臺獲得的實驗結(jié)果相結(jié)合的時候，光學(xué)圖譜法可以迅速、價廉的得到排列好的定向的contigs組，由此可以產(chǎn)生一個將近完整的基因組。

　�。ㄈ�）發(fā)展方向

　　Contigs組裝過程的關(guān)鍵點(diǎn) 在于如何得到正確的連接順序。現(xiàn)階段此方面研究多集中在這一方向。

　　五、前景與展望

　　隨著生物學(xué)研究向微觀、向基因領(lǐng)域逐步延伸，高通量測序作為獲得基因序列的主要方法，越來越受到重視，拼接技術(shù)也在不斷發(fā)展。高通量測序的基因片段會變得海量且短小，應(yīng)對此變化，拼接技術(shù)也會由確定“唯一的基因序列”向確定“最可能的基因序列”完成轉(zhuǎn)變。因此，新一代的拼接技術(shù)會在準(zhǔn)確率、覆蓋率和速度上，作出超于現(xiàn)在拼接技術(shù)的改進(jìn)。

　　參考文獻(xiàn)：

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