微生物對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集機(jī)理研究

　　1 引言
　　目前，生物修復(fù)被認(rèn)為是最為經(jīng)濟(jì)有效的處理石油污染土壤的技術(shù)，主要依靠環(huán)境中的微生物以有機(jī)污染物為碳源進(jìn)行新城代謝，從而凈化土壤[1-2]。微生物細(xì)胞膜的功能之一是擴(kuò)散屏障，即阻止碳?xì)浠�合物和親脂性化合物向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散[3]，但大量研究表明吸附在微生物細(xì)胞表面的烴類物質(zhì)主要通過(guò)三種方式進(jìn)入微生物體內(nèi)，即被動(dòng)運(yùn)輸，主動(dòng)運(yùn)輸和整批轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。Bateman 等[5]發(fā)現(xiàn)即使在細(xì)胞外基質(zhì)中加入ATP 生成抑制劑，萘仍會(huì)順利被轉(zhuǎn)移到降解菌Pseudomona puidat 體內(nèi)，因此認(rèn)為萘通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散方式進(jìn)入微生物體內(nèi)。Shishido [6] 的研究結(jié)果表明，苯酚在濃度低于50 mg·L-1 時(shí)以主動(dòng)運(yùn)輸方式進(jìn)入降解菌體內(nèi)，而在濃度較高時(shí)以被動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入微生物細(xì)胞內(nèi)。Kennedy[7]認(rèn)為細(xì)菌直接吸附在油滴上然后烴類通過(guò)擴(kuò)散或主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入菌株體內(nèi)。Beal R[8]觀察到接種量高時(shí)PG201 對(duì)正十六烷的降解率低于接種量低時(shí)十六烷的降解率，從而推測(cè)這一現(xiàn)象與正十六烷的運(yùn)輸方式有關(guān)。
　　Steinbuchel 和Ratledge[9-11]等人在研究中發(fā)現(xiàn)許多能降解烷烴類物質(zhì)細(xì)菌在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的脂類物質(zhì)，然后微生物將這些親脂性物質(zhì)以特定的形式儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)。文章在此基上，利用兩種高效石油降解菌DQ01 和DQ02 為對(duì)象，研究吸附在微生物表面的正十六烷以何種方式進(jìn)入微生物體內(nèi)，以及細(xì)胞內(nèi)烷烴的存在形式。
　　2 材料和方法
　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器
　　無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）：5%KH2PO4，0.1%NH4Cl，0.02%MgSO4 7H2O，0.0015%CaCl2，1mL 微量元素/L 培養(yǎng)基(每100mL 溶液包含0.5mg CuSO4·5H2O，1.0mg H3BO3，1.0mgMnSO4·5H2O, 7.0mg ZnSO4)，去離子水定容到1000mL，115℃濕熱滅菌20min。
　　葡萄糖液體培養(yǎng)基：0.15%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，去離子水定容到1000mL，115℃濕熱滅菌20min。
　　正十六烷培養(yǎng)基：在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入一定濃度的正十六烷。
　　儀器：Varian3800 氣相色譜儀（美國(guó)瓦里安技術(shù)有限公司），THZ-C 恒溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)公司），真空抽濾裝置（北京康林科技），J-25 型高速離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司），JY96-Π 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝公司），BX41 顯微鏡（OLYMPUS），120kVTecnai20 透射電子顯微鏡（FEI 香港有限公司），UV-240 紫外分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)有限公司）。
　　2.2 實(shí)驗(yàn)方法
　　2.2.1 菌種對(duì)不同濃度正十六的運(yùn)輸富集試驗(yàn)
　　將微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后4℃下儲(chǔ)存。細(xì)胞從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。移取5mL 培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，過(guò)濾掉上清液后，剩下的菌體用5mL 滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，并以5mL 滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，加入一系列不同濃度（1、10、20、30、40、50、100 mg·L-1）的正十六烷，20min 后將培養(yǎng)液離心，菌體用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細(xì)胞2 次，再用滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以去除吸著在表面的烷烴。然后重懸于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超聲破壁，每次3s 共60 次，每次間隔7s， 離心分離(7000r/min,10min)，上清液用等體積正己烷超聲萃取2 次。收集有機(jī)相，并用無(wú)水硫酸鈉脫水，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)定容到1mL，用GC 測(cè)定濃度。富集的烷烴就是DQ01 和DQ02 體內(nèi)烷烴的量。
　　2.2.2 菌種細(xì)胞內(nèi)外正十六烷含量分析
　　這部分實(shí)驗(yàn)是為了分析烷烴從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)是順濃度梯度還是逆濃度梯度。具體方法如下：微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后4℃下儲(chǔ)存。細(xì)胞從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，然后菌體用5mL 滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到一系列試管中，加入20 mg·L-1 十六烷，分別在1、2、5、10、15、20、30、40、60min 里將細(xì)菌離心，菌體用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細(xì)胞2 次，再用滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，用GC 測(cè)定清洗溶液中的正十六烷，即為吸著在微生物表面的烷烴。細(xì)胞膜內(nèi)烷烴富集量的分析見(jiàn)2.2.1。
　　2.2.3 NaN3 抑制條件下，菌種運(yùn)輸富集正十六烷的試驗(yàn)
　　微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，然后菌體用5mL 滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到正十六烷培養(yǎng)基（DQ01 和DQ02 中正十六烷的濃度分別為20 mg·L-1）中， 30℃，150r/min 培養(yǎng)25min，其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3，分別在1min，4min，5 min，8min，10min，14min，18min，25min 取出5mL 細(xì)菌離心，菌體用無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細(xì)胞2 次，再用滅菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以去除吸著在表面的烷烴，收集清洗液，測(cè)定上清中正十六烷的濃度變化。然后重懸于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超聲破壁，每次3s 共60 次，每次間隔7s， 離心分離(7000r/min,10min)，上清液用等體積正己烷超聲萃取2 次。收集有機(jī)相，并用無(wú)水硫酸鈉脫水，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)定容到1mL，用GC 測(cè)定菌種體內(nèi)的濃度。
　　2.2.4 超薄切片的制備和微生物體內(nèi)包涵體的觀察
　　參考 Preusting H [12]所用方法：將生長(zhǎng)48h 的微生物離心后，倒去上清，2.5％戊二醛固定4h，PBS 緩沖液沖洗3 次，1％鋨酸固定2h，PBS 緩沖液沖洗3 次。然后分別用30%、50%、70%、80％、90％、95％、100％乙醇脫水，每次15min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹(shù)脂按3?1 比例混合，放入樣品，靜置60min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹(shù)脂按1?1 比例混合，放入樣品，靜置60min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹(shù)脂按1?3 比例混合，放入樣品，靜置60min。將樣品放入EPON812 樹(shù)脂，靜置60min。將樣品用EPON812 樹(shù)脂包埋劑進(jìn)行包埋，60℃下放置24h。將聚合好的包埋塊修塊、超薄切片，然后醋酸雙氧鈾染色30min，檸檬酸鉛染色30min，最后進(jìn)行電鏡觀察。對(duì)電鏡內(nèi)細(xì)胞中包涵體物的情況進(jìn)行分析。對(duì)照是用葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的2 種菌種在培養(yǎng)48h 后用上面的步驟處理。
　　2.2.5 GC 條件
　　采用 Varian3800 氣相色譜儀，色譜柱為HP-SE-54(30m，0.25mmid),載氣（N2）流速為16-20cm/s，進(jìn)樣口分流比為60?1，進(jìn)樣口溫度為250℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度為300℃，柱溫100℃保持2min，并以10℃/min 升溫到250℃保留10min。
　　3 結(jié)果與討論
　　3.1 不同正十六烷濃度對(duì)菌種運(yùn)輸富集的影響
　　從圖可看出，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 體內(nèi)富集正十六烷的含量隨初始培養(yǎng)液中正十六烷濃度的增加而增加，且在各個(gè)濃度水平上，DQ01 細(xì)胞內(nèi)富集的正十六烷量高于DQ02 體內(nèi)正十六烷的富集量，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，2 菌株細(xì)胞外正十六烷濃度的增大可以加大2 株菌對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集。如當(dāng)培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為20 mg·L-1時(shí)，20min 后，進(jìn)入DQ01 細(xì)胞內(nèi)的正十六烷濃度為2.76 mg·L-1，而當(dāng)培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為40 mg·L-1 時(shí)，進(jìn)入DQ01 細(xì)胞質(zhì)中的正十六烷濃度為5.22 mg·L-1。原因?yàn)�，正十六烷的濃度增大，加大了微生物�?duì)有機(jī)底物的接觸幾率，從而增加了進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物的含量。但隨著初始正十六烷濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中富集的正十六烷含量趨于穩(wěn)定，如正十六烷初始濃度分別大于50 mg·L-1 和30 mg·L-1 時(shí)，DQ01 和DQ02 細(xì)胞內(nèi)富集的正十六烷增加緩慢，可見(jiàn)，正十六烷降解菌細(xì)胞膜內(nèi)富集底物的能力與有機(jī)底物的初始濃度有關(guān)，這一現(xiàn)象與Kappeli.O 研究結(jié)果一致[13]。隨著培養(yǎng)液中正十六烷含量的增加，微生物DQ01 和DQ02并沒(méi)有表現(xiàn)出中毒性狀，2 株菌體內(nèi)富集的烷烴量反而增加，這是因?yàn)槲⑸�物通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性和細(xì)胞膜中不同脂肪酸含量比例來(lái)適應(yīng)毒性逐漸增加的環(huán)境，并發(fā)揮對(duì)有機(jī)底物的降解功能[14]。隨著培養(yǎng)液中烷烴含量的增加，細(xì)胞膜中順式和反式不飽和脂肪酸的比例降低，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例的增加都能增大細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而彌補(bǔ)了有機(jī)物對(duì)微生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)[15-16]，因此仍需深入分析DQ01 和DQ02 細(xì)胞膜中以及膜內(nèi)不同脂肪酸的組成比例，從而更好地掌握微生物對(duì)烷烴的運(yùn)輸機(jī)制。
　　3.2 菌種運(yùn)輸富集正十六烷的機(jī)理分析
　　微生物能降解去除環(huán)境中的有害有機(jī)物，但對(duì)于微生物如何將這些有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)，人們的認(rèn)識(shí)還很有限。被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是物質(zhì)順濃度梯度進(jìn)行的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式，此過(guò)程不需消耗細(xì)胞本身代謝能，穿膜動(dòng)力來(lái)自物質(zhì)自身的熱運(yùn)動(dòng)或濃度差。主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)是通過(guò)消耗細(xì)胞自身代謝能進(jìn)行的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，需要膜上專一性載體,其轉(zhuǎn)運(yùn)速度一般比被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)要快很多，可以逆濃度梯度運(yùn)輸，從而使生活在低基質(zhì)環(huán)境中的微生物獲得營(yíng)養(yǎng)[17]。
　　這部分實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞內(nèi)外濃度差方面分析正十六烷的跨膜運(yùn)輸方式。從圖2 可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為20 mg·L-1 時(shí)，在實(shí)驗(yàn)階段吸附在DQ01 細(xì)胞表面的正十六烷濃度均小于被菌種運(yùn)輸富集到體內(nèi)的正十六烷濃度，如在第0-10min 這個(gè)時(shí)間段里，DQ01細(xì)胞表面吸附的烷烴量呈增大趨勢(shì)，并在第10min 達(dá)到吸附最大值1.10 mg·L-1，而DQ01 細(xì)胞內(nèi)富集的烴濃度為2.72 mg·L-1，之后，細(xì)胞膜上吸附的烷烴量趨于穩(wěn)定，整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，DQ01 以逆濃度梯度方式將正十六烷運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌體內(nèi)。DQ02 運(yùn)輸正十六烷的方式與DQ01不同，在實(shí)驗(yàn)前10min，DQ02 細(xì)胞膜上吸附的正十六烷含量高于細(xì)胞內(nèi)富集的烴含量，并在第10min 二者含量相同，均為2.01 mg·L-1，此后，DQ02 吸附的烷烴量開(kāi)始下降，并低于細(xì)胞內(nèi)富集的烷烴量。20min 后，DQ02 細(xì)胞膜上和體內(nèi)富集的正十六烷含量趨于穩(wěn)定，因此DQ02 首先以順濃度梯度方式運(yùn)輸烷烴，之后，以逆濃度梯度方式將烷烴運(yùn)輸?shù)骄�種體內(nèi)，即DQ02 先后通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)運(yùn)輸運(yùn)過(guò)程將烷烴運(yùn)輸?shù)? 菌株體內(nèi)。此外，DQ01 細(xì)胞膜上的烴含量明顯低于DQ02 細(xì)胞吸附的烴，分析其原因可能與降解菌膜內(nèi)，膜周和胞外酶的降解能力不同有關(guān)[18]。蠟狀芽孢桿菌DQ01 的降解酶主要定域于膜周和膜內(nèi)，且膜內(nèi)酶的降解能力高于膜周酶，這種差別促使更多的十六烷以逆濃度梯度方式運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)被降解；芽孢桿菌DQ02 的降解酶主要定域于胞外和膜內(nèi)，且降解能力相同，所以細(xì)胞膜內(nèi)外的烴濃度差不明顯。
　　3.3 NaN3 抑制條件下，菌種運(yùn)輸富集正十六烷的規(guī)律
　　王紅旗[19]等人的研究表明加入正十六烷進(jìn)入30 mmol·L-1 的NaN3 可使正十六烷在菌體內(nèi)的富集量均減少80％以上，因此微生物運(yùn)輸烷烴是需要能量的。這部分實(shí)驗(yàn)選用能阻止細(xì)胞氧化磷酸化的NaN3 為抑制劑從而阻止ATP(三磷酸腺苷)的生成，如果加入合適濃度的NaN3 后菌種體內(nèi)富集的正十六烷減少，則說(shuō)明該菌種運(yùn)輸正十六烷的方式是需要能量的，相反，如果加入的NaN3 并未影響菌種體內(nèi)富集正十六烷，則說(shuō)明這個(gè)過(guò)程是不需要能量的被動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程。為進(jìn)一步研究NaN3 抑制條件下不同時(shí)間內(nèi)菌種主動(dòng)運(yùn)輸富集正十六烷的情況，分別在1min，4min，5min，8min，10min，14min，18min，25min 等一系列時(shí)間內(nèi)測(cè)定菌和上清液中正十六烷的濃度變化（其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3），以過(guò)程中不加入NaN3 后測(cè)定的菌體內(nèi)正十六烷濃度為對(duì)照。
　　如圖3a 和圖3b 所示，在8.5min 加入NaN3 之前，2 菌株體內(nèi)運(yùn)輸富集的正十六烷濃度略有增高，培養(yǎng)液中的正十六烷濃度基本不變，之后隨著抑制劑NaN3 的加入，2 菌株體內(nèi)富集的正十六烷明顯下降，相應(yīng)上清液中的正十六烷濃度則明顯增加。以DQ01 為例，在加入NaN3 時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)正十六烷含量為3.12 mg·L-1，而在加入NaN3 的第10min,細(xì)菌體內(nèi)正十六烷含量迅速降為1.54 mg·L-1，而對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)正十六烷含量為3.17 mg·L-1，上清液中的正十六烷含量也由加入NaN3 前的16.54 mg·L-1 增加到18.52mg·L-1。結(jié)果表明，NaN3 抑制了DQ01 對(duì)正十六烷的主動(dòng)運(yùn)輸。發(fā)生這種變化的原因?yàn)椋�微生物�?xì)胞內(nèi)，烴類物質(zhì)的主動(dòng)運(yùn)輸和生物降解是同時(shí)發(fā)生的，但當(dāng)主動(dòng)運(yùn)輸受阻時(shí)，進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的底物減少，但存在于細(xì)胞內(nèi)的烴被不斷生物降解，因此，加入NaN3 后，菌株體內(nèi)富集的烴含量降低，細(xì)胞外又有烷烴不斷憎溶到水相中，因此上清液中烷烴含量會(huì)有所增加。相似的結(jié)果也在其它文獻(xiàn)中有報(bào)道。Aristeides K[20]的研究表明在培養(yǎng)液中加入能阻止ATP 生成的疊氮化鈉和2，4-二硝基苯酚都能使Arthrobacter sp. strain Sphe3 體內(nèi)富集的菲含量。Whitman[21]等人發(fā)現(xiàn)P.
　　fluorescens 通過(guò)與能量有關(guān)的特殊運(yùn)輸系統(tǒng)降萘攝入體內(nèi)。只有經(jīng)過(guò)引誘處理的降解菌Mycobacterium sp. strain RJGII-135 才能通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式攝取菲[22]。
　　3.4 細(xì)胞膜內(nèi)包涵體的觀察
　　石油類物質(zhì)作為基質(zhì)通常需要由特定的、誘導(dǎo)性的運(yùn)輸系統(tǒng)吸收到細(xì)胞內(nèi)，這對(duì)石油的微生物降解尤其重要。那么，進(jìn)入微生物體內(nèi)的正十六烷又是以何種狀態(tài)存在的還需要進(jìn)一步試驗(yàn)分析。Kennedy[23]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Acinetobacter sp.在以正十六烷和正十七烷為唯一碳源時(shí)，體內(nèi)均會(huì)出現(xiàn)明顯的包涵體，而在以非烴類化合物為碳源時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)包涵體。
　　本次實(shí)驗(yàn)用TEM 對(duì)2 株菌體內(nèi)的包涵體進(jìn)行了觀察，結(jié)果如圖4 和圖6 所示，以正十六烷為唯一碳源時(shí)，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 的菌種體內(nèi)均出現(xiàn)了包涵體，但2 株菌中包涵體的形態(tài)不同差異，如圖4 所示，DQ01 體內(nèi)的包涵體數(shù)目較多，呈透明、光滑的球狀，而DQ02 的包涵體不規(guī)則，并分散在菌種體內(nèi)（如圖6）。而在以葡萄糖為唯一碳源時(shí)，2 株菌體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)包涵體（如圖5 和圖7），說(shuō)明這些包涵體完全只與烴類的代謝有關(guān)，微生物通過(guò)未修飾烷烴的運(yùn)輸作用把烷烴轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的烷烴氧化部位，所以出現(xiàn)了包涵體，這些包涵體的主要成分可能是中性脂質(zhì)和未改變的正十六烷，并且由含有多種蛋白質(zhì)的單分子層磷脂薄膜包圍[24-25]。但具體成分需要GC-MS 進(jìn)一步分析。
　　Hector[26]等人發(fā)現(xiàn)在不同碳源培養(yǎng)基中，細(xì)菌Rhodococcus opacus strain PD630 體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)球狀和不規(guī)則狀包涵體，其形狀的不同與組成包涵體的脂類和親脂性化合物不同有關(guān)。
　　當(dāng)Rhodococcus opacus strain PD630 以正構(gòu)烷烴為基質(zhì)時(shí)，其體內(nèi)包涵體中的主要脂類物質(zhì)為與基質(zhì)含有相同碳原子數(shù)的烷鏈酸以及烷鏈酸；在以葡萄糖酸、乙酸和果糖為基質(zhì)時(shí)，Rhodococcus opacus strain PD630 包涵體中的脂類物質(zhì)主要是十六酸；而在以丙酸為基質(zhì)時(shí)，組成包涵體的物質(zhì)主要為奇數(shù)碳原子數(shù)的烷鏈烴，如十五烷和十七烷等。因此，需對(duì)DQ01和DQ02 體內(nèi)包涵體中的組分進(jìn)一步定性分析，從而揭示2 菌株對(duì)烷烴的富集機(jī)制。
　　4 結(jié)論
　�。�1）微生物細(xì)胞內(nèi)能富集正十六烷，且富集量隨時(shí)間有逐漸增大趨勢(shì)。不同濃度的正十六烷導(dǎo)致2 株菌對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集量不同，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，正十六烷的濃度增大可以加大2 株菌對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集，但到一定濃度，細(xì)胞體內(nèi)富集的正十六烷的量趨于穩(wěn)定。
　�。�2） 在20min 的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，DQ01 細(xì)胞膜上吸附的正十六烷含量低于體內(nèi)富集的烷烴量，屬于逆濃度梯度運(yùn)輸；而DQ02 細(xì)胞膜上吸附的正十六烷含量在前期高于體內(nèi)富集的烷烴量，在后期呈相反狀態(tài)，說(shuō)明DQ02 先后通過(guò)順濃度梯度和逆濃度梯度方式將烷烴運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)。
　�。�3）加入NaN3 之前 DQ01 體內(nèi)運(yùn)輸富集的正十六烷濃度略有增高，8.5min 加入NaN3后，菌種對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集能力明顯下降，相應(yīng)上清中的正十六烷濃度則明顯增加。在加入NaN3 之前芽孢桿菌DQ02 的體內(nèi)正十六烷濃度基本處于穩(wěn)定水平，加入NaN3 后運(yùn)輸富集到菌體內(nèi)的正十六烷也立刻減少，表明在微生物運(yùn)輸正十六烷的過(guò)程中是需能的，屬于主動(dòng)運(yùn)輸。
　�。�4）以正十六烷為唯一碳源時(shí)，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 的菌種體內(nèi)均出現(xiàn)了包涵體，而包涵體并沒(méi)有出現(xiàn)在以葡萄糖為碳源的2 株菌體內(nèi), 說(shuō)明DQ01 和DQ02可以未加修飾地將烷烴運(yùn)輸富集在體內(nèi)的初始氧化部位。2 株菌中包涵體的形態(tài)存在一定差異，以正十六烷為唯一碳源時(shí)，DQ01 體內(nèi)的包涵體數(shù)目較多，呈透明、光滑的球狀，而DQ02 的包涵體呈不規(guī)則狀，并分散在菌種體內(nèi)。造成這一現(xiàn)象的原因可能與組成包涵體的脂類物質(zhì)有關(guān)。

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【微生物對(duì)正十六烷的運(yùn)輸富集機(jī)理研究】相關(guān)文章：

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