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生命科學(xué)圖像采集系統(tǒng)論文
1共焦顯微原理與系統(tǒng)方案
基于針孔式掃描盤建立的快速共焦顯微系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示，激發(fā)光源發(fā)出的光經(jīng)過準(zhǔn)直、擴(kuò)束之后，透過分光鏡，依次經(jīng)過快速掃描盤和顯微物鏡。物鏡匯聚的激發(fā)光照射在樣品上，樣品受激發(fā)射的熒光按照原光路返回，當(dāng)發(fā)射熒光經(jīng)過快速掃描系統(tǒng)時(shí)，被濾去物方非焦面發(fā)射的雜散光。分光鏡反射的熒光經(jīng)過透鏡匯聚后被CCD接收，獲取樣品共焦顯微圖像。通過控制樣品在Z軸上步進(jìn)，進(jìn)而改變樣品的光切位置，可以獲得樣品不同切面的圖像，最終通過一定的圖像處理技術(shù)可以獲得樣品的三維圖像。
2EMCCD相機(jī)結(jié)構(gòu)與組件內(nèi)容
圖1所建立的共焦顯微系統(tǒng)以針孔盤作為掃描部件，它以多點(diǎn)針孔同時(shí)對視場進(jìn)行掃描，因此，圖像采集器件宜采用面陣器件，綜合探測靈敏度、圖像輸出幀頻、空間應(yīng)用等角度考慮，系統(tǒng)采用EMCCD作為圖像采集器件。它與傳統(tǒng)CCD器件在感光、存儲(chǔ)等結(jié)構(gòu)上并無差異，之所以在探測靈敏度、信噪比上表現(xiàn)出色，是因?yàn)樵谄渥x出寄存器之后又多出了一串增益寄存器，增益寄存器的單個(gè)倍增單元如圖2所示。與普通的三相CCD轉(zhuǎn)移電極相比，EMCCD將Ф2分為Ф2和Фdc，一般Фdc接2V左右的直流偏置，Ф2接高壓(40V左右)轉(zhuǎn)移時(shí)鐘，由于Ф2與Фdc之間存在高壓差，當(dāng)信號(hào)電荷從Ф1向Ф2轉(zhuǎn)移時(shí)，強(qiáng)電場會(huì)使電荷加速并與其他電荷碰撞產(chǎn)生新的電子，電子被Ф2勢井收集實(shí)現(xiàn)1次信號(hào)倍增。單個(gè)倍增單元的倍增率是隨機(jī)的，一般在1%～1．5%范圍內(nèi)，雖然單個(gè)倍增單元增益很低，但當(dāng)多個(gè)倍增單元級聯(lián)時(shí)，總增益由式(1)確定G=(1+g)n．(1)其中，g為單個(gè)倍增單元的倍增率，n為倍增單元數(shù)，當(dāng)n取500時(shí)，總增益可能達(dá)2000倍以上。系統(tǒng)采用英國E2V公司的CCD97器件作為成像探測器［3］，CCD97是減薄背照式幀轉(zhuǎn)移型EMCCD，具有512×512有效像素，像素尺寸為16μm×16μm，它同時(shí)具有普通模式與倍增模式成像方式，相應(yīng)具有兩路讀出放大器。倍增模式下制冷到－40℃，可達(dá)30photons/pixel/s(積分時(shí)間為0．1s)的探測能力，滿足弱光探測需求，同時(shí)在11MHz像素時(shí)鐘下，噪聲低于1電子/pixel，量子效率達(dá)90%以上，滿足高幀頻需求。整套系統(tǒng)的電子學(xué)設(shè)計(jì)圍繞EMCCD的驅(qū)動(dòng)需求展開，按功能主要?jiǎng)澐譃?個(gè)模塊:邏輯驅(qū)動(dòng)模塊、功率驅(qū)動(dòng)模塊和上位機(jī)圖像采集模塊，系統(tǒng)功能框圖如圖3所示。
2．1邏輯驅(qū)動(dòng)模塊
邏輯驅(qū)動(dòng)模塊主要完成EMCCD幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出等邏輯信號(hào)輸出、AD時(shí)序控制輸出、SＲAM時(shí)序控制輸出以及圖像數(shù)據(jù)串行輸出等功能，邏輯模塊核心器件采用ACTEL公司的APA300器件，它基于Flash技術(shù)，無需配置芯片，功耗低，對固件錯(cuò)誤有較好的免疫作用，可以抵御一些高能粒子的沖擊，最大優(yōu)勢在于在特殊環(huán)境下可以穩(wěn)定可靠地工作，適合航天領(lǐng)域的應(yīng)用。圖像信號(hào)采集部分用AD9824，它是ADI公司一種專用于CCD信號(hào)處理的AD器件，它包含14位精度最高采樣率為30MSPS的A/D轉(zhuǎn)換器，芯片內(nèi)部集成了相關(guān)雙采樣電路、像素增益放大器、可編程增益放大器。邏輯驅(qū)動(dòng)模塊的硬件程序各子模塊的調(diào)用關(guān)系如圖4所示。
2．2功率驅(qū)動(dòng)模塊
CCD97的驅(qū)動(dòng)除了對信號(hào)相位要求嚴(yán)格外，還要求信號(hào)電平和上升時(shí)間多樣化，針對不同信號(hào)的電平和上升時(shí)間需求，功率驅(qū)動(dòng)模塊采用4種電路方案，包括偏置電平電路、圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)電路(ФIS，ФＲ)及高壓時(shí)鐘電路。由于CCD97直流偏置所需電流不大，所以，偏置電平電路采用電阻分壓與運(yùn)放跟隨實(shí)現(xiàn)。圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)上升時(shí)間較短，需要較大的驅(qū)動(dòng)電流，圖像幀轉(zhuǎn)移、行轉(zhuǎn)移、行輸出信號(hào)功率驅(qū)動(dòng)電路以EL7457作為核心器件。它是Elantec公司推出的四通道CMOS專用驅(qū)動(dòng)器，最高工作頻率可達(dá)40MHz，最大驅(qū)動(dòng)電流2A，具有低輸出阻抗、外圍電路簡單、方便電源管理等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于多電平復(fù)雜時(shí)序的CCD器件驅(qū)動(dòng)設(shè)計(jì)。圖像轉(zhuǎn)移信號(hào)功率驅(qū)動(dòng)電路如圖5所示［4］，由于ФI，s，ФＲ信號(hào)的上升時(shí)間要求不同，實(shí)際調(diào)試電路時(shí)選擇合適的電阻器(Ｒ1～Ｒ5)使得信號(hào)上升時(shí)間盡量滿足器件需求，保證輸出的圖像質(zhì)量較高。高壓時(shí)鐘是實(shí)現(xiàn)倍增模式成像的關(guān)鍵信號(hào)，它的電平?jīng)Q定了倍增增益，并最終影響器件在低照度下的成像效果。由于高壓時(shí)鐘的電平較高，一般在40V左右，驅(qū)動(dòng)電流100mA左右，使用集成元件很難實(shí)現(xiàn)，所以，高壓時(shí)鐘電路采用分立元件實(shí)現(xiàn)，電路如圖6所示［5］。圖中電路的靜態(tài)偏置由二極管D1，D2，D3，D4，D5，D6以及電阻器Ｒ1，Ｒ3，Ｒ4所組成的分壓網(wǎng)絡(luò)提供。Q1的柵源極靜態(tài)電壓約為－1V，Q2的柵源極靜態(tài)電壓約為1V。當(dāng)FPGA驅(qū)動(dòng)脈沖為低時(shí)，U1和U2的輸出為5V，Q1的柵源極電壓為－1V，Q2的柵源極電壓為6V，此時(shí)，Q1關(guān)斷，Q2導(dǎo)通，2HV被拉低到0V;當(dāng)FPGA脈沖為高時(shí)，U1和U2的輸出為0V，Q1的Vgs為－6V，Q2的Vgs為1V，此時(shí)Q2關(guān)斷，Q1導(dǎo)通，Ф2HV被拉高到電源電壓Vhigh。Ф2HV的輸出相位與FPGA輸出邏輯信號(hào)相同，高低電平與高壓電源一致。
2．3上位機(jī)軟件
上位機(jī)控制軟件主要負(fù)責(zé)指令編碼、指令下傳以及圖像數(shù)據(jù)接收、圖像數(shù)據(jù)存儲(chǔ)、圖像顯示等工作。上位機(jī)軟件開發(fā)環(huán)境為VC++6．0，通過調(diào)用操作系統(tǒng)自帶的MScomm控件完成指令下傳與數(shù)據(jù)接收。通過點(diǎn)擊界面上的“打開串口”按鈕建立相機(jī)與上位機(jī)間的通信，點(diǎn)擊“打開相機(jī)”按鈕完成相機(jī)參數(shù)與開機(jī)指令下傳，開啟圖像數(shù)據(jù)接收線程，待正確接收數(shù)據(jù)包頭并完成一整幅圖像數(shù)據(jù)接收后，顯示接收圖像并保存圖像數(shù)據(jù)。
3圖像采集驗(yàn)證與分析
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)鏡頭采用MV2514機(jī)器視覺鏡頭，該鏡頭放大倍率為0．23倍，焦距為25mm，F(xiàn)數(shù)可小至1．4，可見光波段內(nèi)透過率約90%，機(jī)械接口為標(biāo)準(zhǔn)C接口，可兼容2/3inCCD，最小工作距130mm。實(shí)驗(yàn)中采用6mm特寫環(huán)在0．01lx微光、100ms積分時(shí)間、2dB增益條件下使用普通模式與倍增模式分別對同一目標(biāo)成像，圖像如圖7所示。從獲得的暗背景條件下的圖像數(shù)據(jù)可計(jì)算出噪聲平均灰度值與方差，分別選擇普通模式下與倍增模式下目標(biāo)圖像的最亮點(diǎn)作為信號(hào)，取多幅圖像數(shù)據(jù)的亮點(diǎn)信號(hào)并計(jì)算平均值，可以獲得普通模式下與倍增模式下的信噪比，列于從表中可以得出:相比普通模式，在44V倍增時(shí)鐘電壓驅(qū)動(dòng)下，倍增模式輸出圖像的信號(hào)有7倍提升，信噪比也有8倍提升，證明CCD97在微弱光條件下，使用倍增模式可以獲得較高質(zhì)量的目標(biāo)圖像。根據(jù)圖1搭建共焦顯微系統(tǒng)，使用40倍物鏡對擬南芥進(jìn)行熒光顯微成像。普通顯微模式與共焦顯微模式分別對樣品所成圖像如圖8所示。EMCCD相機(jī)倍增模式與普通模式使用相同AD增益，積分時(shí)間分別取100，50ms。從圖8可以看出:EMCCD在倍增模式下可以獲得比較清晰的擬南芥葉肉共焦顯微熒光圖像。相比普通顯微模式，由于對樣品進(jìn)行光切的原因，使得系統(tǒng)在共焦顯微模式下可以清晰的分辨出擬南芥葉肉葉綠體。
4結(jié)論
通過對空間生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)中共焦顯微的原理分析，提出一套適用于活體目標(biāo)觀察、對樣品低損傷的共焦顯微方案。根據(jù)目標(biāo)的掃描方案和獲取目標(biāo)發(fā)射光的能量大小提出基于CCD97的弱光圖像采集系統(tǒng)，將系統(tǒng)分成3個(gè)功能模塊分別實(shí)現(xiàn)并最終完成原理樣機(jī)研制。在普通模式與倍增模式下分別獲取目標(biāo)圖像，從圖像效果可以看出:該成像系統(tǒng)性能較高，對弱光目標(biāo)有很好的成像效果，且該系統(tǒng)具有體積小、可靠性高、適合空間應(yīng)用等特性。
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