探討兔心肌缺血后處理的作用機(jī)制
己有的證據(jù)表明，STAT1和STAT3激活對(duì)心肌具有相反的作用，以下是小編搜集整理的一篇探究兔心肌缺血后處理的作用機(jī)制的論文范文，供大家閱讀參考。
缺血后處理(ischemicpostconditioning,IPO)即通過(guò)在心肌的再灌注早期經(jīng)過(guò)反復(fù)短暫的缺血與再灌注,能減少心律失常的發(fā)生,改善心功能,縮小梗死面積,減少心肌細(xì)胞凋亡[1]。
Murry等[2]提出的預(yù)處理不同,IPO是在缺血后、再灌注之前進(jìn)行反復(fù)短暫的缺血與再灌注。IPO可對(duì)已發(fā)生的心肌缺血事件起到挽救的作用,彌補(bǔ)了不可預(yù)知缺血事件造成的慌亂,盡量減少心肌的損害,有其更大的應(yīng)用前景。但對(duì)其機(jī)制的研究尚未有公認(rèn)的結(jié)論,有待進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)建立兔在體心肌IPO模型[3],觀察JAK-STAT通路在心肌IPO中的作用,進(jìn)一步探討IPO的機(jī)制問(wèn)題。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
新西蘭大白兔,雌雄兼有,體質(zhì)量2.5~3.0kg。將實(shí)驗(yàn)用兔(雌雄兼有)40只隨機(jī)分為3組。組1(單純?nèi)毖俟嘧⒔M,I/R組,n=10)進(jìn)行簡(jiǎn)單的缺血再灌注,暴露左心室前降支(LAD),以1號(hào)絲線于中上1/3處旁開(kāi)1mm進(jìn)針縫線,橫穿LAD,另一端旁開(kāi)1mm出線,剪針,套管,阻斷LAD遠(yuǎn)端血流(以心電圖ST段抬高為標(biāo)志)30分鐘后,開(kāi)放120分鐘。組2(單純?nèi)毖筇幚斫M,IPO組,n=10)于LAD的中上1/3阻斷30分鐘,開(kāi)放后30秒再予阻斷30秒,再開(kāi)放,如此反復(fù)3次。
即進(jìn)行IPO,隨后再灌注120分鐘。組3(AG490+IPO組,n=10)于阻斷后10分鐘給予酪氨酸激酶抑制劑AG490(1mg/kg),其他操作同組2。
1.2材料與試劑
AG490(美國(guó)SIGMA公司);Tunel試劑盒(德國(guó)寶靈曼公司);TKR-200c小動(dòng)物呼吸機(jī)(江西特力麻醉呼吸設(shè)備公司);RM6240C生理信號(hào)采集系統(tǒng)(成都儀器廠);熒光顯微鏡(日本Olympus公司);1.3數(shù)據(jù)采集以阻斷前10分鐘為起點(diǎn),期間每10分鐘記錄1次左心室壓力情況,以LSD(是一種文件格式,由RM6240C系統(tǒng)自動(dòng)生成)文件保存,RM6240C多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)進(jìn)行分析,所得數(shù)據(jù)保存于Excel表格中。每組分別于阻斷即刻、阻斷后20分鐘、再灌注后60分鐘、再灌注后120分鐘抽取2ml血液作為標(biāo)本,進(jìn)行心肌磷酸激酶(CPK)的檢測(cè)。最后處死動(dòng)物,取缺血中心區(qū)心肌,裁減為黃豆大小置入4%多聚甲醛固定液和10%中性緩沖固定溶液中保存,做好標(biāo)記。固定48~72小時(shí)后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,進(jìn)行Tunel檢測(cè)觀察細(xì)胞凋亡情況。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示,組間比較采用方差分析,不同時(shí)點(diǎn)間的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析。
P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1CPK的變化
不同組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),時(shí)點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),組別與時(shí)點(diǎn)間存在交互作用(P<0.01),進(jìn)一步分析組間和時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng),各組的CPK于阻斷后較缺血前明顯增加(P<0.05),組1和組3再灌注120分鐘較60分鐘下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);組2CPK于再灌注60分鐘和120分鐘后較組1顯著降低(P<0.05),而組3與組1再灌注后60分鐘兩者之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果見(jiàn)表1。
2.2心功能指標(biāo)的變化
本實(shí)驗(yàn)以RM6240C多道生理信號(hào)采集系統(tǒng)分析了所記錄的壓力波形,通過(guò)該系統(tǒng)給出的參數(shù),我們對(duì)左心室內(nèi)壓上升及下降最大速率(±dp/dtmax,即在收縮期單位時(shí)間內(nèi)左心室壓力上升的最大速度,以“+”號(hào)表示,反映了心室的收縮功能;舒張期單位時(shí)間內(nèi)心室壓力下降的速度,以“-”號(hào)表示,反映左心室的舒張功能),采用SAS軟件進(jìn)行了LINEPLOT分析,以時(shí)間作為X軸,±dp/dtmax作為Y軸(圖1~3)。
±dp/dtmax是反映左心室收縮功能及舒張功能的重要指標(biāo),越靠近0點(diǎn)表明心功能越差,對(duì)比組1與組2,可看出組1心功能呈下降趨勢(shì);而組2不明顯,說(shuō)明IPO對(duì)心功能起到了保護(hù)作用。組3波形也向0點(diǎn)靠近,說(shuō)明AG490阻斷了后處理的保護(hù)作用。
2.4心肌細(xì)胞凋亡變化
光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞占視野中總細(xì)胞的千分率。
每張切片隨機(jī)選取視野,計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,并計(jì)數(shù)細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞,其總和即為這張切片心肌凋亡細(xì)胞的千分率。在鏡下可以看到組1與組2的陽(yáng)性率較高,并可見(jiàn)凋亡細(xì)胞經(jīng)常簇集在一起;組3的心肌凋亡細(xì)胞相對(duì)較少。組2的細(xì)胞凋亡千分率均小于組1(P<0.01),組3與組1差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。
3討論
在缺血再灌注時(shí)進(jìn)行IPO,激發(fā)機(jī)體的內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制系統(tǒng),最終結(jié)果起到了心肌保護(hù)的作用。但對(duì)于該機(jī)制是存在于器官、組織、細(xì)胞哪一級(jí)水平,作用于哪一條細(xì)胞通路,是一條或是多條通路相互起作用,人們先后提出了各種觀點(diǎn),比如抑制中性粒細(xì)胞活化[4-5],減少氧化劑介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[2-4],抑制細(xì)胞內(nèi)和線粒體內(nèi)鈣超載[5-6],激活再灌注損傷補(bǔ)救激酶途徑(RISK)[6-9]等。本研究通過(guò)建立兔的心肌缺學(xué)后處理模型,研究JAK-STAT通路在兔心肌IPO中的作用,進(jìn)一步探討IPO的作用機(jī)制問(wèn)題。
JAK-STAT通路是人們?cè)谘芯扛蓴_素(IFN-α、IFN-γ)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)的`,JAK和STAT都屬于多成員家族。
JAK家族是一種非受體型酪氨酸蛋白激酶(PTK),其分子質(zhì)量為120000~130000,有JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4個(gè)成員。該家族中的成員由7個(gè)功能域構(gòu)成[10],JH1(JAKhomologyregion1)是有PTK催化活性的激酶功能域;JH2為激酶樣功能域,由于缺乏激酶活化所必需的氨基酸殘基而沒(méi)有激酶活性,同時(shí)是與STAT結(jié)合的部位[11]。STAT是一種DNA結(jié)合蛋白,結(jié)構(gòu)中含有SH2、SH3功能域。
STAT家族共有7個(gè)成員,即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。其結(jié)構(gòu)域中C端的酪氨酸磷酸化(Tyr-P)有助于形成同源或異源二聚體。
研究證實(shí),細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體結(jié)合后,其受體的胞內(nèi)部分發(fā)生二聚體化,JAK與二聚體化受體的box功能區(qū)結(jié)合并發(fā)生磷酸化而激活。活化的JAK進(jìn)一步誘發(fā)二聚體受體復(fù)合物周?chē)腜TK底物活化,包括細(xì)胞因子受體型PTK、JAK家族成員和STAT等。
STAT是JAK激酶底物,可通過(guò)SH2功能域與二聚體受體復(fù)合物的酪氨酸位點(diǎn)以及JAK上的KLD功能區(qū)域結(jié)合。
STAT的y功能域在JAK的作用下發(fā)生Tyr-P,STAT被激活。胞漿內(nèi)活化的STAT通過(guò)SH2功能域形成同源或異源二聚體,如SIF-A(STAT3和P48等構(gòu)成)、SIF-B(STAT3-STAT1)、SIF-C(STAT1-STAT1)等。這些二聚體通過(guò)特定的機(jī)制移位到細(xì)胞核內(nèi)并進(jìn)一步結(jié)合到相應(yīng)靶基因的啟動(dòng)子上,啟動(dòng)基因表達(dá)[12-13]。
我們假設(shè)JAK-STAT通路在心肌的IPO中也發(fā)揮了一定的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中組2較組1在心肌酶、心功能的變化、細(xì)胞凋亡等方面均有明顯的改善,IPO確實(shí)起到了心肌保護(hù)作用,證明本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了兔在體心肌缺血后處理模型。而組3與組2相比,在心肌酶、心功能的變化、細(xì)胞凋亡等方面均無(wú)明顯的改善,說(shuō)明AG490可以消除后處理的保護(hù)作用,而作為JAK-STAT通路的特異性抑制劑,AG490只能通過(guò)作用于JAK-STAT通路,由此可證明JAK-STAT通路在心肌的缺血后處理中也發(fā)揮了不可替代的作用。
2001年,Omura等[14]發(fā)現(xiàn),在體心肌缺血時(shí),血管緊張素(AngⅡ)信號(hào)是心肌JAK-STAT通路激活的主要原因。隨后,Mascareno等[15]發(fā)現(xiàn),缺血再灌注選擇性激活STAT5a和STAT6,激活的STATs與血管緊張素原(angiotensinogen,Ao)基因啟動(dòng)子St結(jié)構(gòu)域結(jié)合,上調(diào)Ao-mRNA的表達(dá)。
2000年,Kodama等[16]研究發(fā)現(xiàn)JAK2抑制劑AG490能夠強(qiáng)烈抑制培養(yǎng)心肌細(xì)胞的ANP的表達(dá),表明JAK-STAT通路參與了血管舒-縮活性肽的表達(dá)。這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致,應(yīng)用AG490后,IPO+AG490組的后處理的保護(hù)作用也被消除。
己有的證據(jù)表明,STAT1和STAT3激活對(duì)心肌具有相反的作用,STAT1的激活誘發(fā)凋亡,而STAT3激活卻抑制凋亡,發(fā)揮心肌保護(hù)作用[17]。
Yamaura等[18]通過(guò)基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn),STAT5a敲除的小鼠其缺血預(yù)處理的保護(hù)作用消失,而STAT6敲除的小鼠其缺血預(yù)處理的保護(hù)作用仍然存在,說(shuō)明STAT5a在缺血預(yù)處理中發(fā)揮了積極作用,而且證明STAT5a可以同時(shí)被JAK-STAT、SrcKinase兩條途徑激活,SrcKinase激活的STAT5a通過(guò)PI3K磷酸化Akt而達(dá)到心肌保護(hù)作用。結(jié)果表明JAK-STAT信號(hào)通路可以通過(guò)和其他通路的交談(cross-talking)而發(fā)揮作用,這就增加了JAK-STAT通路的復(fù)雜性。
新近的研究表明,機(jī)體內(nèi)存在多種下調(diào)JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)途徑,除受體入胞這種常見(jiàn)的信號(hào)下調(diào)途徑外,至少有3個(gè)蛋白質(zhì)家族抑制JAK-STAT信號(hào)通路:細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(supressorsofcytokinesibnalling,SOCS)、活化STATs抑制蛋白(PIASproteininhibitorsofactivatedSTATs)和含有SH2結(jié)構(gòu)域的磷酸酶(SHPSH2-containingphosphatase)[11,19]。SOCS蛋白家族共有7個(gè)成員,即SOCS1-SOCS7。SOCS蛋白家族是STAT激活的靶基因產(chǎn)物。
STAT激活誘導(dǎo)SOCS表達(dá),表達(dá)的SOCS又以負(fù)反饋的形式抑制JAK-STAT信號(hào)通路的活化[19]。目前,SOCS蛋白家族對(duì)JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用己被充分證實(shí),但其發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的確切機(jī)制尚未明了。
PIAS家族是一組能與STATs結(jié)合的蛋白質(zhì)。日前己發(fā)現(xiàn)5個(gè)成員,PTAS1、PTAS3、PIASy、PIASxa、PIASxb。PIAS可與激活的STATs二聚體結(jié)合,阻斷該二聚體與DNA結(jié)合。SHP是存在于細(xì)胞質(zhì)中的磷酸酶。
SHP1,SHP2能使JAKS和STATs去磷酸化,從而發(fā)揮抑制JAK-STAT信號(hào)通路的作用。另一方面,機(jī)體內(nèi)尚存在JAK-STAT信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)機(jī)制,包括絲氨酸激酶和一些相互作用的蛋白質(zhì)。
STATs羧基末端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)絲氨酸殘基,2001Kovarik等[20]研究發(fā)現(xiàn),該絲氨酸殘基磷酸化可增強(qiáng)STAT1、STAT3、STAT4的轉(zhuǎn)錄活性,提高部分靶基因的表達(dá)。此外,STATs還可以和其他的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物相互作用,如:STAT1與NF-B、SP1、糖皮質(zhì)激素受體等,從而構(gòu)成了一個(gè)十分復(fù)雜的調(diào)節(jié)體系。
最后,我們可以認(rèn)為:
�、傩募∪毖筇幚砜梢詼p少心肌酶的釋放,心肌細(xì)胞凋亡,改善心功能。
②JAK-STAT通路參與了缺血后處理的保護(hù)機(jī)制。但是JAK-STAT通路與其他通路的交匯作用,以及JAK-STAT家族中是否全部參與了IPO的保護(hù)機(jī)制還不清楚,有待于進(jìn)一步的研究。
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