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談北豆根提取物中有效成分分析方法的建立
摘要： 目的采用酸性染料比色法測(cè)定北豆根提取物中北豆根總堿（ＴＡＭＤ）的含量，采用高效液相色譜（ＨＰＬＣ）法測(cè)定蝙蝠葛堿（Ｄａｕｒｉｃｉｎｅ）的含量。方法溴甲酚綠在無(wú)水甲醇（ｐＨ ＝６）中，可與ＴＡＭＤ 直接絡(luò)合生成綠色化合物，用于比色測(cè)定，最大吸收波長(zhǎng)為６２０ ｎｍ。ＨＰＬＣ 法，色譜柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８ 柱；流動(dòng)相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５；流速：０．５ ｍｌ·ｍｉｎ－１ ；檢測(cè)波長(zhǎng)：２０８ ｎｍ。結(jié)果酸性染料比色法：線(xiàn)性范圍為６ ～４０ μｇ· ｍｌ－１ ，r ＝０．９９９ ８ （n ＝７），平均加樣回收率為９９．１８％，RSD ＝０．７４％；ＨＰＬＣ 法：線(xiàn)性范圍為０．０１ ～０．１ ｍｇ· ｍｌ－１ ，r ＝０．９９９ ８（n ＝７） ，平均加樣回收率為９８．３２％， RSD＝０．９４％。結(jié)論建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可作為北豆根提取物中ＴＡＭＤ 和蝙蝠葛堿的含量分析方法。關(guān)鍵詞： 北豆根總堿 蝙蝠葛根 酸性染料比色法 高效液相色譜法
北豆根為防己科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum ＤＣ．的干燥根莖，其有效部位是生物堿。現(xiàn)已知北豆根中含有近２０ 種生物堿，總堿含量可達(dá)１％以上，其中含量最高的生物堿為蝙蝠葛堿，其含量約占總生物堿的５０％左右［１］ 。北豆根總堿（ＴＡＭＤ）對(duì)呼吸道致病菌有抑菌作用，尤其對(duì)肺炎球菌效果更為顯著。其制劑北豆根片可治療急性咽炎、扁桃體炎，經(jīng)過(guò)多年的臨床應(yīng)用已收入２００５ 版《中國(guó)藥典》。２００５ 版《中國(guó)藥典》用酸堿滴定法控制含量，終點(diǎn)不易判斷，誤差大。本實(shí)驗(yàn)采用酸性染料比色法測(cè)定提取物中ＴＡＭＤ 的含量，采用高效液相色譜法測(cè)定提取物中蝙蝠葛堿的含量，從而用這兩個(gè)指標(biāo)控制提取物的質(zhì)量。
�。� 器材
ＨＰ －８４５３ 紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)；ＡＧ －２５４ 型電子分析天平（瑞士梅特勒）；ＷＴ －０２ 型電熱恒溫干燥箱（北京恒星醫(yī)療器械廠(chǎng)）；ＺＦＱ －８５Ａ 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海醫(yī)械專(zhuān)機(jī)廠(chǎng)）；Ｒ２００２ 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申順科技公司）；ＪＡＳＣＯ 高效液相色譜儀（ＵＶ －１５ 紫外－可見(jiàn)檢測(cè)器，ＲＵ －１５８０ 泵，ＣＫＣｈｏｍ 色譜工作站，日本）；北豆根飲片（市售，承德產(chǎn)，經(jīng)鑒定為蝙蝠葛）；北豆根堿（對(duì)照品，自制，含量９９．０％）；９５％乙醇、氨水、硫酸、三氯甲烷、無(wú)水甲醇、磷酸、酚酞為分析純； 甲醇、乙腈為色譜純。
２ 方法與結(jié)果
�。玻� 酸性染料比色法測(cè)定提取物中ＴＡＭＤ 的含量［２］
２．１．１ 比色原理不吸收可見(jiàn)光的無(wú)色物質(zhì)通過(guò)絡(luò)合、氧化還原等反應(yīng)生成有色物質(zhì)，可用于比色測(cè)定。實(shí)驗(yàn)證明，溴甲酚綠在無(wú)水甲醇（ｐＨ ＝６）中，可與ＴＡＭＤ 直接絡(luò)合生成綠色化合物，用于比色測(cè)定。
�。玻保� 最大吸收波長(zhǎng)的選擇精密稱(chēng)取蝙蝠葛堿對(duì)照品（６０℃干燥至恒重）１０．０ ｍｇ 置５０ ｍｌ 容量瓶中，加無(wú)水甲醇溶解，最后用無(wú)水甲醇定容至５０ ｍｌ，作為對(duì)照品溶液。
精密吸取對(duì)照品溶液１．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ，用無(wú)水甲醇定容，在２００ ～７００ ｎｍ 進(jìn)行掃描，選擇最大吸收波長(zhǎng)，確定最大吸收波長(zhǎng)為６２０ ｎｍ。
�。玻保� 顯色劑用量的考察分別精密吸�。埃保ヤ寮追泳G溶液０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，再分別加入對(duì)照品溶液１．０ ｍｌ，用無(wú)水甲醇定容，在６２０ ｎｍ 處測(cè)定吸收度。結(jié)果見(jiàn)表１。
表1 蝙蝠葛堿與溴酚綠絡(luò)合后的吸收度（略）
結(jié)果表明，顯色劑用量為０．２ ｍｌ 時(shí)吸收度最大，故選用顯色劑用量為０．２ ｍｌ。
２．１．４ 顯色穩(wěn)定性的考察以加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ的樣品為考察對(duì)象，在１２０ ｍｉｎ 內(nèi)于６２０ ｎｍ 處測(cè)定吸收度，隨行試劑空白。結(jié)果見(jiàn)表２。
表2 蝙蝠葛堿的顯色穩(wěn)定性考察（略）
平均吸收度為０．４２３，RSD為０．０３％，表明吸收度在１２０ ｍｉｎ內(nèi)沒(méi)有明顯變化。
�。玻保� 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備分別精密吸取對(duì)照品溶液０．３，０．５，０．８，１．０，１．２，１．５，２．０ ｍｌ，置１０ ｍｌ 容量瓶中，加入０．１％溴甲酚綠溶液０．２ ｍｌ，于６２０ ｎｍ 測(cè)定吸收度，隨行試劑空白。以蝙蝠葛堿濃度C 對(duì)吸收度A 進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程：C ＝４９．９１A －０．８８，r ＝０．９９９ ８ （n ＝７），線(xiàn)性范圍為６ ～４０ μｇ· ｍｌ－１ 。
�。玻保� 精密度實(shí)驗(yàn)取２．１．５ 中的樣品（２０ μｇ· ｍｌ－１ ）測(cè)定吸收度，重復(fù)測(cè)定５ 次，平均吸收度為０．４２３，RSD 為０．１１％。
�。玻保� 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱(chēng)取北豆根提取物２．０ ｍｇ（總堿含量以北豆根堿計(jì)為９２．７％），置１０ ｍｌ 容量瓶中，加無(wú)水甲醇使溶解，超聲提�。保� ｍｉｎ，用無(wú)水甲醇定容至１０ ｍｌ，總堿濃度以蝙蝠葛堿計(jì)０．１８５ ｍｇ· ｍｌ－１ 。蝙蝠葛堿對(duì)照品溶液濃度為０．２ ｍｇ· ｍｌ－１ 。分別精密吸取兩種溶液各０．４，０．５，０．６，０．８，１．０ ｍｌ，一一對(duì)應(yīng)混合于１０ ｍｌ 容量瓶中，無(wú)水甲醇定容。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表３。
表3 TAMD的回收率（略）
２．２ 高效液相色譜法測(cè)定提取物中蝙蝠葛堿含量［３］
�。玻玻� 色譜條件色譜柱：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ －Ｃ１８ （５ μｍ，４．６ ｍｍ ×２５０ ｍｍ）；流動(dòng)相：乙腈∶水∶磷酸＝１６∶８４∶０．１５（V∶V∶V）；流速：０．５ ｍｌ· ｍｉｎ－１；波長(zhǎng)２０８ ｎｍ；柱溫：室溫；進(jìn)樣量２０ μｌ；理論塔板數(shù)２ ３００。
�。玻玻� 北豆根對(duì)照品、提取物和藥材的ＨＰＬＣ 的圖譜見(jiàn)圖１。
圖1 北豆根對(duì)照品提取物和藥材的HPLC圖譜（略）
�。玻玻� 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制精密稱(chēng)取蝙蝠葛堿對(duì)照品（６０℃干燥至恒重）５．０ ｍｇ 置２５ ｍｌ 容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照溶液０．５，１．０，１．５，２．０，３．０，４．０，５．０ ｍｌ 置１０ ｍｌ 容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，以峰面積（Y）對(duì)濃度（X）進(jìn)行直線(xiàn)回歸，得回歸方程為：Y ＝１．５３ ×１０８ X ＋１．１８ ×１０４ ；r ＝０．９９９ ８ （n ＝７） ， 線(xiàn)性范圍為０．０１ ～０．１ ｍｇ· ｍｌ－１ 。
２．２．４ 精密度實(shí)驗(yàn)選用“
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