還原型谷胱甘肽對培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響
作者：王進，王一彪，趙麗麗，孔春妍
【摘要】 目的 研究還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧(A/R)損傷的影響。方法 建立心肌細胞A/R損傷模型，隨機分為５組：A組，正常對照組；B組，單純?nèi)毖?復氧(A/R低氧2h，復氧1h)組；C、D、E組為還原型谷胱甘肽處理組，加入還原型谷胱甘肽(GSH)分別使其終濃度為40、80、160 mg/L，后A/R。于復氧后測定各組培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)變化及細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和細胞存活率。結(jié)果 與正常組相比，單純低氧/復氧組LDH漏出量、MDA水平顯著升高(P<0.01)，細胞存活率顯著降低(P<0.01)。與缺氧/復氧組比較，各谷胱甘肽處理組上述變化明顯減輕(P<0.05)。結(jié)論 還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞A/R損傷具有保護作用，并具有濃度依賴性。
【關(guān)鍵詞】 還原型谷胱甘肽 心肌細胞 缺氧 復氧
The effects of reduced glutathione sodium on anoxia/reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes
【Abstract】 Objective To study the effects of reduced glutathione sodium(GSH) on anoxia /reoxygenation injuries of neonatal rat cardiomyocytes.Methods A/R model of myocardial cells of neonatal rats was established. The cells of neonatal rats were randomly divided into five groups: control group(A): without any treatment; A/R group(B):2-hour anoxia followed by 1-hour reoxygenation; GSH conditioned group(C):adding GSH into culture medium till the final concentration of 40mg/L then A/R; GSH conditioned group (D):adding GSH into culture medium till the final concentration of 80mg/L then A/R; GSH conditioned group (E):adding GSH into culture medium till the final concentration of 160mg/L then A/R. The activity of lactate dehydrogenase(LDH)，the contents of cellular melondadehyde(MDA) and the rate of cell viability of each group were evaluated after reoxyenation.Results Compared with group A，the A/R group showed a great increase in levels of LDH，MDA and a decrease in the rate of cell viability(P<0.01). Compared with group B，the GSH conditioned groups significantly attenuated these changes(P<0.05).Conclusion GSH could be a protective effect on A/R injury of neonatal rat cardiomyocytes in a concentration dependent manner.
【Key words】 reduced glutathione sodium cardiomyocytes anoxia reoxygenation
1 與方法
1.1 材料 實驗用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山東大學實驗動物中心提供，雌雄不拘；DMEM培養(yǎng)基由愛博公司出品；胎牛血清為美國 Gibco公司出品；胰酶為Sigma公司出品；丙二醛（MDA），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自南京建成生物研究所；還原型谷胱甘肽（古拉定）由 Laboratorio Farmaceutico C.T.S.R.1生產(chǎn)(批號：4027)。
1.2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 無菌取出生1～3天大鼠乳鼠心臟，剪碎后用0.25％胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15％胎牛血清的高糖DMEM 中止消化，離心取心肌細胞沉淀，加入培養(yǎng)液，集中混勻制成懸液，應用差速貼壁法分離純化心肌細胞，以5×105/ml的培養(yǎng)密度接種于２４孔培養(yǎng)板中， 在CO２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液。
1.3 實驗分組及操作程序 試驗分為５組，每組重復８孔，A組為正常對照組（培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3h結(jié)束實驗）；B組為單純?nèi)毖酰瘡脱踅M（A/R 缺氧2h，復氧1h）：將培養(yǎng)板置于充有99.５％氮氣的缺氧孵育器中37℃密閉培養(yǎng)2h，再以９5％氧氣＋５％二氧化碳進行復氧1h；C組，D組，E組為古拉定處理組，加入古拉定使其終濃度分別為40、80、160mg/L。各組缺氧前、復氧前均給。
1.4 實驗檢測指標 (1)計數(shù)細胞搏動：在倒置顯微鏡觀察并計數(shù)心肌細胞搏動的頻率及節(jié)律。(2)細胞存活率計數(shù)：采用臺盼藍排斥法檢測，各組取少許細胞混懸液，0.4%臺盼藍混勻2min，按白細胞計數(shù)法在光鏡下計數(shù)藍染細胞。臺盼藍攝取率＝藍染細胞／（藍染細胞＋未藍染細胞）×100%。(3)LDH及MDA活性及含量測定：實驗結(jié)束后按試劑盒說明測定。
1.5 學方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)
2 結(jié)果
2.1 古拉定對缺氧/復氧心肌細胞搏動的影響 正常培養(yǎng)對照組心肌細胞搏動相對恒定，節(jié)律規(guī)則；A/R組心肌細胞搏動頻率減慢，搏動幅度減弱，節(jié)律不齊，有部分停搏，與對照組相比，差異有非常顯著性（P<0.01)；各古拉定處理組明顯逆轉(zhuǎn)A/R 損傷造成的搏動頻率和節(jié)律異常，與A/R 組比較差異有顯著性（P<0.05)。
2.2 古拉定對心肌細胞缺氧/復氧損傷LDH及MDA的影響 結(jié)果表明，A/R心肌損傷是十分明顯的，而古拉定能明顯減輕這種損傷，古拉定處理組各觀察指標均差異有顯著性，因此提示古拉定對于缺氧／復氧心肌細胞損害具有保護作用，且存在量效關(guān)系，見表1。
表1 還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧損傷LDH及MDA的影響 (x±s)
注：B組與A組比較，P＜0.01；與B組比較，**P＜0.01；與B組比較，*P＜0.05
3 討論
3.1 還原型谷胱甘肽對缺氧／復氧心肌細胞損傷的影響 大量研究表明，缺血再灌注期間大量氧自由基的產(chǎn)生可造成細胞損傷。氧自由基導致細胞損傷主要環(huán)節(jié)為作用于細胞外基質(zhì)，使膠原和透明質(zhì)酸崩解，使膜磷脂結(jié)構(gòu)的多聚不飽和脂肪酸過氧化而直接損傷細胞膜；肌漿網(wǎng)和線粒體崩潰，心肌細胞在缺氧缺糖條件下，ATP產(chǎn)生減少，代謝障礙，代謝產(chǎn)物堆積，使膜穩(wěn)定性降低，溶酶體釋放，導致生物損傷、變性，使LDH釋放在培養(yǎng)基中，同時再給氧時氧自由基增加，細胞膜受攻擊，細胞膜損傷。細胞內(nèi)LDH進一步增加，故LDH釋放量是觀測缺血再灌注損傷重要指標。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，其含量變化可作為評定自由基生成及對膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞的指標。本實驗從培養(yǎng)的未成熟鼠心肌細胞入手，排除了在體和離體灌注模型中神經(jīng)、體液因素及其他混雜細胞因素的影響，直接利用還原型谷胱甘肽處理培養(yǎng)的.未成熟鼠心肌細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽各濃度組均可降低缺氧／復氧損傷造成的心肌細胞死亡率，減少細胞內(nèi)LDH漏出，減少細胞內(nèi)MDA生成，且存在量效關(guān)系，表明還原型谷胱甘肽對未成熟鼠心肌細胞有保護作用。
3.2 還原型谷胱甘肽對缺氧／復氧心肌細胞損傷的保護機制 還原型谷胱甘肽(GSH)對清除自由基有重要作用，它是機體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能有效清除氧化產(chǎn)生的自由基，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)定，并在使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害方面起重要作用［4］。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用下對有機過氧化物(ROOH)和無機過氧化物(H2O2)起重要清除作用，其還可以起維生素C還原劑的作用，使維生素C成為還原型而不斷清除超氧自由基。近期有研究表明［5］，GSH可維持線粒體內(nèi)膜巰基基團的還原狀態(tài)。當GSH含量下降，內(nèi)源性自由基攻擊線粒體蛋白巰基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影響線粒體氧化代謝的3個關(guān)鍵酶及傳遞鏈中酶的活性，NADH減少，ATP產(chǎn)生減少。另一方面，導致膜蛋白巰基氧化交聯(lián)，構(gòu)型改變，線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)運通道打開，鈣釋放增加，胞漿鈣上升，激活細胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，導致細胞膜的損傷或死亡。本實驗表明補充外源性GSH，對保護細胞膜的功能可能具有重要意義，對臨床各種疾患造成的心肌細胞缺氧／復氧損傷有保護作用。
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