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中藥芪參復(fù)康對焦慮模型大鼠βEP及細胞因子的影響
【摘要】 目的： 對中藥芪參復(fù)康 (QSFK) 膠囊抗焦慮作用的神經(jīng)?免疫調(diào)節(jié)機制進行初步探討. 方法： 采用國際通用的高架十字迷宮模型(EPM)焦慮動物模型，用丁螺環(huán)酮(Bus)作對照，觀察QSFK對EPM大鼠β?EP，血清NO，IL?1β，IL?6和TNFα的影響. 結(jié)果： 與模型組比較，QSFK和Bus均能降低EPM大鼠血漿β?EP含量(P<0.01)，對下丘腦β?EP水平無明顯影響;但兩組均能升高EPM焦慮模型大鼠血清NO水平(P<0.05);QSFK還可升高EPM大鼠血清IL?1β和TNFα水平，對IL?6含量無明顯影響;Bus并不能改變此焦慮模型大鼠的血清細胞因子水平. 結(jié)論： QSFK降低血漿β?EP含量，提高血清NO濃度和EPM血清IL?1β和TNFα水平，以調(diào)節(jié)焦慮狀態(tài)下機體免疫功能紊亂.
0引言
芪參復(fù)康 (qishenfukang, QSFK) 膠囊是我院臨床主要用于治療肝血不足，血不養(yǎng)心，虛熱內(nèi)擾之虛煩不得入眠引起的焦慮癥方劑. 以往實驗結(jié)果表明，QSFK膠囊可增加動物的自發(fā)活動，增強其體力，并能逆轉(zhuǎn)強制冷水游泳應(yīng)激所致腎上腺VitC含量的變化[1]，顯示該制劑具有抗應(yīng)激和抗焦慮作用. 我們采用國際上通用的焦慮動物模型高架十字迷宮模型(the elevated plus?maze test, EPM)，觀察了QSFK對EPM大鼠β?內(nèi)啡肽(β?EP)、血清一氧化氮(NO)、白細胞介素1β(IL?1β)、白細胞介素6(IL?6)、腫瘤壞死因子α(TNFα)等細胞因子水平的影響，對本方抗焦慮作用的神經(jīng)?免疫調(diào)節(jié)機制進行初步探討.
1材料和方法
1.1材料SD品系雄性大鼠，體質(zhì)量(180±10)g，由西安交通大學實驗動物中心提供. QSFK膠囊是由炙黃芪15 g、西洋參10 g、白術(shù)10 g、天麻10 g、枸杞子10 g、熟地黃10 g、白芍10 g、阿膠10 g、丹參10 g、當歸10 g、川芎10 g、淫羊藿10 g、酸棗仁15 g、遠志10 g、茯苓10 g、鹿茸5 g中藥材組成. 由本院中藥制劑中心提供，0.3 g/粒. 丁螺環(huán)酮片劑(buspirone, Bus)5 mg/片，為西南合成制藥股份有限公司產(chǎn)品. 研缽粉碎后用蒸餾水溶解，加入20 g/L羧甲基纖維素鈉1～2滴充分混勻，配成100 g/L濃度. 4℃保存，使用前混搖均勻. β?EP放免試劑盒由第二軍醫(yī)大學神經(jīng)生物學教研室提供;IL?1β，IL?6，TNFα放免試劑盒由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免研究所提供; DigBehv?EPMR型大鼠高架十字迷宮為上海吉量軟件科技有限公司產(chǎn)品;SN?695B型智能放免γ測量儀為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品;DU?7型紫外分光光度計為美國Beckman公司產(chǎn)品.
1.2方法大鼠每籠10只，不限食水. 室溫(18±2)℃，保持安靜. 將大鼠隨機分為模型,BUS, QSFK共3組，每組10只. 其中QSFK組按1.2 g/(kg·d)給予灌胃，Bus組給予1 mg/(kg·d)灌胃，模型組灌服等容積的生理鹽水. 各組連續(xù)給藥10 d，末次給藥1 h后做行為學測試[2]. 大鼠EPM行為學測試結(jié)束后，立即斷頭處死，迅速在冰盤上剪開顱蓋和腦膜，分離下丘腦，稱質(zhì)量，制成勻漿，加入1 mol/L HAC 1 mL，室溫放置2 h，再加入1 mol/L NaOH 1 mL，中和酸，4℃，4000 r/min，離心20 min，取上清液，置-20℃冰箱保存待測下丘腦β?EP;斷頭取血，其中2 mL置于加入0.3 mol/L EDTA?2Na 40 μL和抑肽酶40 μL抗凝劑的試管中，4℃，4000 r/min，離心20 min，取血漿，待測血漿β?EP;其余血液室溫放置，3000 r/min，離心20 min，取血清，-20℃冰箱保存待測NO, IL?1β, IL?6, TNFα. 其中NO測定按照NO試劑盒(南京生物醫(yī)學制劑公司)說明在DU?7型紫外分光光度計上測定NO濃度. β?EP, IL?1β, IL?6, TNFα均采用放免法嚴格按試劑盒說明書方法進行測定.
統(tǒng)計學處理： 各組數(shù)據(jù)用x±s表示，采用單因素方差分析(One?way ANOVA)及Student Newman Keuls檢驗，全部數(shù)據(jù)用SPSS 11.0 for windows統(tǒng)計軟件處理.
2結(jié)果
2.1QSFK對EPM大鼠β?EP的影響與模型組比較，Bus和QSFK組大鼠下丘腦β?EP水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但血漿β?EP含量降低(P<0.05, P<0.01);血清NO水平均升高(P<0.05)，其中QSFK組升高更為明顯(表1). 表1QSFK對EPM大鼠β?EP和NO的影響
2.2QSFK對EPM大鼠血清細胞因子的影響與模型組比較，QSFK組大鼠血清IL?1β, TNFα水平升高(P<0.05)，但血清IL?6含量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05);Bus組大鼠的血清IL?1β, IL?6 和 TNFα均無統(tǒng)計學意義(表2). 表2QSFK對EPM大鼠血清免疫細胞因子水平的影響
3討論
焦慮癥可能通過神經(jīng)?內(nèi)分泌?免疫機制對機體健康產(chǎn)生廣泛影響. 我們分別選取中樞神經(jīng)、免疫系統(tǒng)與焦慮發(fā)病密切相關(guān)的神經(jīng)調(diào)質(zhì)、免疫細胞因子為觀測指標，探察QSFK對EPM模型大鼠相關(guān)指標的影響，以探討其與抗焦慮作用可能有關(guān)的神經(jīng)?免疫調(diào)節(jié)機制. 研究發(fā)現(xiàn)，焦慮與腦干的LC神經(jīng)釋放增加有關(guān)，能抑制LC釋放β?EP的藥物被認為具有抗焦慮作用[3]. 因此神經(jīng)肽與焦慮的關(guān)系近來倍受關(guān)注. 本結(jié)果顯示，QSFK可顯著降低EPM大鼠血漿β?EP水平，對中樞β?EP無明顯影響，推測QSFK可能抑制了焦慮應(yīng)激狀態(tài)下垂體β?EP的釋放，或者直接作用于腎上腺髓質(zhì)而抑制了β?EP的產(chǎn)生. 我們發(fā)現(xiàn)，QSFK可降低EPM大鼠血漿β?EP水平，推測其有可能通過抑制EPM焦慮狀態(tài)下的β?EP釋放以減少5?HT的釋放，改善焦慮狀態(tài);同時還可通過降低外周β?EP水平，減弱β?EP對免疫抑制作用，以改善焦慮癥可能出現(xiàn)的免疫功能紊亂.
NO被認為是焦慮障礙的神經(jīng)生物化學機制之一,有研究報道焦慮患者血中NO濃度顯著降低. 我們觀察到，1 mg/kg Bus可以明顯升高經(jīng)EPM探究后大鼠血清NO水平，推測作為抗焦慮藥物Bus的抗焦慮作用除了已經(jīng)了解到的對中樞神經(jīng)遞質(zhì)、調(diào)質(zhì)影響之外，可能還包括對NO調(diào)節(jié)的機制，值得進一步研究. 實驗結(jié)果還顯示，QSFK也可顯著升高EPM大鼠血清NO水平，提示其抗焦慮作用可能與提高血清NO濃度有關(guān). 免疫系統(tǒng)對神經(jīng)系統(tǒng)的影響是通過IL?lβ, TNFα等細胞因子實現(xiàn)的，這些被稱為免疫調(diào)節(jié)遞質(zhì)的細胞因子的激活可以引起一系列生理、行為、情感和認知的改變. 迄今為止，焦慮與其伴有的機體免疫功能改變的心身交互作用機制及其因果關(guān)系目前尚不十分清楚，有關(guān)焦慮患者免疫功能的研究結(jié)論也不一，但有許多資料表明焦慮患者確實存在免疫功能的失調(diào)[5]，在異常免疫狀態(tài)可引發(fā)焦慮[6]. 我們觀察到，在經(jīng)EPM探究后即刻時間，1.2 g/kg劑量QSFK可以顯著提高EPM大鼠血清IL?1β，TNFα水平，對IL?6影響不明顯，提示QSFK可使EPM大鼠經(jīng)EPM探究本已升高的細胞因子水平繼續(xù)升高，推測可能與加強機體對外來刺激的防御性保護反應(yīng)有關(guān). 我們發(fā)現(xiàn)，QSFK可降低EPM焦慮模型大鼠β?EP的釋放，提高血清NO水平，推測QSFK有可能通過上述途徑實現(xiàn)對機體免疫功能的調(diào)節(jié)，改善焦慮癥可能伴有的免疫功能失調(diào).
【參考文獻】
[1] 李新田，邱財榮，楊來啟，等. 芪參復(fù)康膠囊對強制冷水游泳應(yīng)激大鼠行為及腎上腺Vitc含量的影響[J]. 中國藥房，2007：18(增刊)：3-4.
[2] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實驗方法學[M]. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：817.
[3] 沈漁邨. 精神病學[M]. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：678-683.
[4] 鐘慈聲，孫安陽. 一氧化氮的生物醫(yī)學[M]. 上海： 上海醫(yī)科大學出版社，1997：89.
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