試論不同凍干保護劑對利巴韋林凍干粉針的影響論文
在制備凍干粉針劑的過程中，為了保護藥品的活性，獲得均勻、一致、表面光滑、穩(wěn)定的產(chǎn)品，必須加入起到填充、賦形、穩(wěn)定作用的保護劑，很多糖類或多元醇經(jīng)常被用于溶液凍融和凍干過程中的穩(wěn)定劑。常用的保護劑有糖類(如葡萄糖、乳糖等)、多元醇(如甘露醇、山梨醇等)、氨基酸類(如甘氨酸、谷氨酸等)、無機鹽類(如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等)和大分子類(如明膠等)。它們既是有效的低溫保護劑，又是很好的凍干保護劑，它們對凍結(jié)的影響取決于種類和濃度。但在實際應(yīng)用中，因沒有依據(jù)而廣泛嘗試大量保護劑種類，并通過大量實驗摸索確定保護劑品種的凍干參數(shù)是對資源、時間的浪費。本實驗以利巴韋林為模型藥物，同時輔以空白組作為對比，研究蔗糖、無水乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、氯化鉀、甘氨酸7 種不同類型常用凍干保護劑的預(yù)凍時間、用量、凍干時間等凍干參數(shù)，并比較其凍干后的外觀和復(fù)溶效果、含水量、pH 值、主藥含量變化等相關(guān)性能，以期對凍干劑制備時保護劑的選擇提供依據(jù)。
1 材料
BX51TRF 型顯微鏡(奧林巴斯株式會社);BSl10S 型萬分之一電子分析天平、P8-10 型pH 酸度計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DW-86L626 型超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司);LGJ-12 型冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司);FD-1C-50 冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);Lyo-0.4 型真空冷凍干燥機(上海東富龍科技有限公司);HCT 型微機差熱天平(北京恒久科學(xué)儀器廠);Waters 超高效液相色譜儀：二元溶劑管理系統(tǒng)、在線脫氣機、自動進樣器、PDA檢測器(美國Waters 公司)。利巴韋林由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖(批號K43921892)、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇(批號M759903247)、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸(批號VP559490329)、Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇(批號M630297337)、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀(批號A0519420 )、Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖(批號K45447546413)均由默克化工技術(shù)(上海)有限公司提供;無水乳糖(上海昌為醫(yī)藥輔料技術(shù)有限公司，批號1320012820)。
2 方法與結(jié)果
2.1 凍干粉針的制備
2.1.1 利巴韋林凍干粉針的制備按照處方量精密稱取利巴韋林250 mg 以及適量凍干保護劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過，分裝于5 mL 西林瓶，1 mL/瓶，25 mg/mL。80℃低溫預(yù)凍后放入凍干機中干燥。
2.1.2 空白凍干粉針的制備按照處方量精密稱取適量凍干保護劑，用注射用水溶解，定容至10 mL，以0.45 μm 微孔濾膜濾過，分裝于5 mL 西林瓶，1mL/瓶，25 mg/mL。80 ℃低溫預(yù)凍后放入凍干機中干燥。
2.1.3 凍干粉針的外觀和復(fù)溶效果取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，凍干保護劑用量為10%，預(yù)凍15 h，凍干15 h，初步比較不同凍干保護劑的凍干效果。Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇凍干失敗，原輔料損失;Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖和無水乳糖凍干后外觀和復(fù)溶均良好，但放置后逐漸塌陷;Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀凍干粉針的外觀飽滿平整、復(fù)溶迅速完全。
2.2 預(yù)凍時間的考察
取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，凍干保護劑用量為10%，凍干15 h，考察不同凍干保護劑的適用的最短預(yù)凍時間。鑒于2.1.3 的結(jié)果，凍干失敗的原因有可能與預(yù)凍不完全有關(guān)，故不同的凍干保護劑選擇了不同的預(yù)凍時間水平進行考察。依據(jù)降低能耗、節(jié)約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇預(yù)凍時間Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖24 h，無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸和Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀均為9 h，Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.3 凍干保護劑用量的考察取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，按照2.2的結(jié)果確定不同凍干保護劑的預(yù)凍時間，凍干15 h，考察不同凍干保護劑、不同用量水平適用的最少用量。依據(jù)降低能耗、節(jié)約能源的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖10%，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為4%，Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.4 凍干時間的考察取利巴韋林凍干粉針和空白凍干粉針，按照2.2的結(jié)果確定不同凍干保護劑的預(yù)凍時間，按照2.3的結(jié)果確定不同凍干保護劑的用量，考察不同凍干保護劑的適用的最短凍干時間。依據(jù)節(jié)約輔料的原則，在取得同樣效果的前提下，選擇Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖15 h，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、甘氨酸、氯化鉀和無水乳糖均為6 h，Emprove低內(nèi)毒素葡萄糖、山梨醇仍然失敗。
2.5 驗證試驗
依據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定最優(yōu)條件，進行 3次驗證實驗，結(jié)果見表5。所得凍干粉針除Emprove低內(nèi)毒素甘氨酸表面略有裂隙外，其他凍干粉針均外觀飽滿、平整，同時所有凍干粉針劑均能夠迅速、完全復(fù)溶。
2.6 含水量的測定
采用庫侖法測定含水量。取適量樣品，減重法稱量，加入C30 庫侖法卡爾費休水分儀中，輸入樣品編號和質(zhì)量后進行測定，最終含水量均為3 批樣品含水量的平均值，結(jié)果見表 6，均符合凍干制劑含水量低于5%的要求。
2.7 pH 值的測定
取凍干前的樣品溶液 2 mL，將pH 計探頭插入溶液中，直到pH 計讀數(shù)不變，此時的讀數(shù)即為所求pH 值;凍干后的樣品以凍干前相同體積的水復(fù)溶后，取2 mL 用pH 計測定pH 值。取實驗所得樣品測定凍干前后的pH 值，最終pH 值均為3 批樣品的平均值，結(jié)果見表7。凍干后pH 值變化不大，考慮到pH 計存在一定的測量誤差，總體認為pH 值沒有根本性改變，影響不大。
2.8 利巴韋林凍干粉針中利巴韋林的測定
2.8.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC HSST3 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);流動相為純水;體積流量0.25 mL/min;柱溫30 ℃;樣品室溫度4 ℃;檢測波長206 nm;進樣量1 μL。
2.8.2 對照品溶液的制備精密稱定利巴韋林對照品4.01 mg，置10 mL 量瓶中，純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.3 供試品溶液的制備取空白凍干粉針劑和利巴韋林凍干粉針劑各1 瓶，分別用純水溶解，并各自轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻，即得。
2.8.4 專屬性試驗分別取空白凍干粉、利巴韋林凍干粉和利巴韋林對照品溶液，進樣測定，并記錄色譜圖。
2.8.5 標(biāo)準曲線的建立精密稱定利巴韋林對照品10.03 mg，置25 mL 量瓶中，純水溶解并稀釋至刻度，搖勻即得0.40 mg/mL 利巴韋林對照品儲備液。分別精密移取上述儲備液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL 置10 mL 量瓶中，純水稀釋至刻度，搖勻即得質(zhì)量濃度分別為12、24、36、48、60、72 μg/mL對照品溶液。將上述對照品溶液進樣分析，并記錄色譜圖。以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程Y=2 591.8 X-1 974.1，R2=0.999 7，表明利巴韋林在12～72 μg/mL 與峰面積線性關(guān)系良好。
2.8.6 精密度試驗取利巴韋林凍干粉針劑1 瓶，制備供試品溶液，連續(xù)進樣測定6 次，結(jié)果利巴韋林峰面積的RSD 值為1.7%。
2.8.7 重復(fù)性試驗取同一批利巴韋林凍干粉針劑6 瓶，制備供試品溶液，進樣測定，結(jié)果利巴韋林質(zhì)量分數(shù)的RSD 值為2.1%。
2.8.8 穩(wěn)定性試驗吸取利巴韋林凍干粉針劑供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 進樣測定，計算得利巴韋林峰面積的RSD 值為2.2%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.8.9 加樣回收試驗取已知量的利巴韋林凍干粉針劑供試品共9 份，精密加入一定量利巴韋林對照品溶液，制備供試品溶液6 份，進樣測定。結(jié)果利巴韋林的平均回收率為101.1%，RSD 值為1.7%。
2.8.10 樣品測定取利巴韋林凍干粉針劑樣品，制備供試品溶液，進樣測定，外標(biāo)法計算樣品凍干前和凍干后利巴韋林的質(zhì)量分數(shù)。
3 討論
實驗選擇了 7 種凍干保護劑進行比較研究，其中Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖和Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇在不同因素水平下均未能成功制備粉針劑。Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove低內(nèi)毒素甘氨酸均能在適宜條件下制備粉針劑。從節(jié)約能耗的角度考慮，Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、無水乳糖4 種保護劑更為適合選擇，尤以Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇為佳。實驗研究了Emprove 低內(nèi)毒素蔗糖、無水乳糖、Emprove 低內(nèi)毒素葡萄糖、Emprove 低內(nèi)毒素甘露醇、Emprove 低內(nèi)毒素山梨醇、Emprove 低內(nèi)毒素氯化鉀、Emprove 低內(nèi)毒素甘氨酸7 種不同類型常用凍干保護劑作為水溶性藥物利巴韋林凍干保護劑的性能，確定了一些基本參數(shù)，為水溶性藥物凍干粉針劑的制備提供了參考。
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